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时间:2018-09-16
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1、广西区妇幼保健院司法鉴定所标DNA提取标准操作规程文件编号:FYSJ1-SOP-04-2013标题:DNA提取标准操作规程版号:第1版文件类型:受控页码:第5页共5页DNA提取标准操作规程1.目的:规范不同检材的DNA提取操作程序,确保DNA质量,保证STR分型结果准确性。2.原理:Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂,含有成对的亚氨基二乙酸盐离子,可螯合多价离子,特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下,可以使细胞膜破裂,并使蛋白质变性,通过离心除去Chelex颗粒,使其结合的物质与DNA分离。磁珠法提取核酸是通
2、过细胞裂解液裂解细胞,从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面,而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后,再在磁场作用下,使磁性颗粒与液体分开,回收颗粒(即磁珠-DNA混合物),再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。3.操作者:具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。4.标本:5%EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5%EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。5试剂:5.1试剂的厂家及规格:5.1.1DNA抽提试剂Chelex-100伯乐公司(Bio-RadLaboratories,Inc.CAU.S.A)。
3、5.1.2DNA抽提试剂PromegaPP18或PP21DNASystem抽提试剂盒。5.1.3DNA抽提试剂口腔棉签制备基因组DNA试剂盒(G&T,U.S.A)5.1.4无水乙醇分析纯5.1.5异丙醇分析纯5.1.6无菌的超纯水由实验室技术人员制备。5.2试剂的配制:5.2.15%Chelex-100的配制:称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中,加入灭过菌的超纯水至100ml。5.2.2灭菌超纯水的制备:用干净的试剂瓶装超纯水1升左右,经121℃灭菌30分。6仪器及设备:6.1生物安全柜。6.2高速离心机。广西区妇幼保健院司法鉴定所标DNA提取标准操作规程文件编号:FYSJ1
4、-SOP-04-2013标题:DNA提取标准操作规程版号:第1版文件类型:受控页码:第5页共5页6.3超速冷冻离心机。6.4移液器,单道微量移液器(0.5-10ul单道)、单道微量移液器(10-100ul单道)、单道微量移液器(100-1000ul单道)、八道移液器(0.5-10ul八道)和八道移液器(10-100ul八道)。6.5涡旋混匀器。6.6半导体温控混匀器。6.7超纯水制造系统。7操作程序:7.1全血或脐血的DNA抽提(Chelex-100法)7.1.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.1.2按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5mlEP管,加无菌超
5、纯水980ul。7.1.3核对血样,用移液器混匀,吸取1.5ul标本于EP管中(-80℃存放超过一个月的血样取2-3.5ul)。7.1.4颠倒混匀,12600rpm离心3.5min,弃上清,剩余沉淀约20ul。7.1.5加无菌超纯水980ul,颠倒混匀,12600rpm离心3.5min,弃上清,剩余沉淀约20ul。7.1.6取混匀的5%Chelex-100溶液200ul于EP管中(吸取时注意先摇匀5%Chelex-100),盖紧EP管,振荡约15~20sec后,56℃孵浴0.5~2h。7.1.7孵浴结束后振荡约15~20sec,99℃孵浴8min。7.2羊水或绒毛A抽提(Chelex
6、-100法)7.2.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.2.2按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5mlEP管,加无菌超纯水700ml。7.2.3核对标本,用移液器混匀,吸取300ml于EP管中。7.2.4颠倒混匀,12600rpm离心3.5min,弃上清,剩余沉淀约20ul。7.2.5加无菌超纯水1000ul,颠倒混匀,12600rpm离心3.5min,弃上清,剩余沉淀约20ul。7.2.6取混匀的5%Chelex-100溶液200ul于EP管中(吸取时注意先摇匀5%Chelex-100),盖紧EP管,振荡约15~20sec后,56℃孵浴0.5~2h。7.2
7、.7孵浴结束后振荡约15~20sec,99℃孵浴8min。7.2.8孵浴结束后趁热振荡约15~20sec,12600rpm离心3.5min,上清即为DNA溶液。广西区妇幼保健院司法鉴定所标DNA提取标准操作规程文件编号:FYSJ1-SOP-04-2013标题:DNA提取标准操作规程版号:第1版文件类型:受控页码:第5页共5页7.3毛发的DNA抽提(Chelex-100法)7.3.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.3.2按照PCR-STR基因扩
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