总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性

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1、j≮936713分类号UDC+4学校代码10566学号200302001密级广秉晦C莩大学GuangdongOceanUniversity硕士学位论文总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性邵海艳指导教师姓名章超桦教授(博士)专业名称水产品加工及贮藏工程研究方向水产品深加工论文提交同期2006年4月27R总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性中文摘要大量研究表明，海藻的主要成分——硫酸多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤与免疫调节等多种生理功能，但至目前为止，研究的海藻硫酸多糖主要来源于红藻与褐藻，来源于绿藻的极少。总状蕨藻(Caulerparacemosa)属绿藻f-

2、](chlorophyta)蕨藻科植物，是世界性的热带藻类，不仅广泛分布于我国的台湾、海南和广东，还分布于日本、马来半岛和太平洋东岸等地，产量高，但目前尚未得到充分利用。为了充分认识与高值化利用该资源提供科学依据，本文对其硫酸多糖的提取、分离、理化性质、抗肿瘤与免疫活性进行了初步研究。本文的主要工作及结果如下：1．在单因素实验基础上，采用正交实验，确定了总状蕨藻多糖的提取工艺与工艺参数。总状蕨藻多糖提取工艺为：热水与蛋白酶酶解相结合提取。工艺参数为固液比l：10，蛋白酶用量136．5U／g，60℃酶法提取2．5h后，再将固液比调至1：20，在温度95℃条件下继续进行热水提取2．5h，多糖得

3、率为6．7％，比单纯热水提取时的多糖得率提高了131．0％，还大大简化了后续繁琐的除蛋白工艺。2．热水与蛋白酶酶解相结合浸提得到的总状蕨藻多糖提取液经Sevage法和透析法等步骤初步纯化后得到的总状蕨藻硫酸多糖(CaulerpaRacemosaSulfatedPolysaccharide，简称为CRSPl)；以DEAE．52纤维素为固定相和不同浓度的NaCl为流动相对CRSPl进行分段洗脱，分别得到O．5M和1．OMNaCl洗脱的两个主要级分CRSPlA和CRSPIB。3．采用苯酚．硫酸法、硫酸．咔唑法、Folin．酚法和BaCl2．明胶法分别对CRSPl、CRSPlA和CRSPlB的中性

4、糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量和硫酸基含量进行了测定；采用气相色谱法分析了CRSPl、CRSPlA和CRSPlB的单糖组分；采用氨基酸自动分析仪分析了CRSPl、CRSPlA和CRSPlB的氨基酸组成；采用Sepharose4B凝胶柱测定了CRSPlA和CRSPlB的分子量分布。化学组成测定结果显示，CRSPl、CRSPlA和CRSPIB的中性糖含量分别为53．7％、36．0％和45．1％，糖醛酸含量分别为7．9％、3．9％和7．6％，蛋白质含量分别为9．9％、14．O％和2．0％，硫酸基含量分别为27．6％、45．6％和48．3％；气相色谱分析结果显示，CRSPl由11．4％甘露糖、56

5、．8％葡萄糖和31．8％半乳糖组成，CRSPlA由10．9％甘露糖和89．1％葡萄糖组成，CRSPlB由0．8％葡萄糖和99．2％半乳糖组成；氨基酸分析结果显示，CRSPl、CRSPlA和CRSPlB中的氨基酸组成相似，天门冬氨酸和谷氨酸含量异常高，其次是丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸，色氨酸和组氨酸含量最低；分子量测定结果表明，CRSPlA和CRSPlB是至少含有两个组分的混合物，CRSPlA由分子量为136．5×104和14．4×104的两部分组成，CRSPlB由分子量为14．4×104和9．9×104的两部分组成。4．采用MTT法检测了未去游离蛋白总状蕨藻多糖CRSP、去游离蛋白多糖CRSP

6、l以及CRSPlA和CRSPlB对K562细胞增殖的抑制作用，体内实验采用灌胃给药观察了CRSP和CRSPl对小鼠H22实体瘤的抑制作用。结果发现，CRSP和CRSPl在体内外均具有抑制肿瘤细胞生长的作用，并且在相同剂量条件下，CRSPl的抗肿瘤活性明显强于CRSP的抗肿瘤活性；CRSPl、CRSPlA和CRSPlB在体外对K562细胞生长都具有显著抑制作用，同剂量下CRSPl的抑制率最高，其次是CRSPlA，CRSPlB的抑制率最低，其中CRSPl和CRSPlA在中剂量的抑制率达到最高值，而CRSPlB的抑制率随着剂量的增加呈递减趋势。5．采用腹腔注射与灌胃两种方式给药，观察了CRSPl

7、对小鼠S180肉瘤的抑制作用以及对小鼠免疫器官和碳廓清指数的影响，结果显示，CRSPl采用腹腔注射与灌胃两种方式给药，对小鼠S180肉瘤均具有显著的抑制作用，且腹腔注射能显著地增加小鼠的脾脏指数，灌胃给药能显著升高小鼠碳廓清指数。这些事实表明，增强机体的免疫功能可能是总状蕨藻多糖抗肿瘤作用的机制之一。6．采用体外免疫试验方法检测了CRSPl、CRSPlA和CRSPlB直接或协同有丝分裂原ConA对正常小鼠脾淋巴细胞的增殖