SNT2772-2011国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７２—２０１１国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犳狉狅犿犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７７２—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归

2、口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡孔新、王汉华、杨鹏飞、平芮巾、孙肖红、杨宇、王静、张乐。Ⅰ犛犖／犜２７７２—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法１范围本标准规定了国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法，包括样本抗原和核酸快速检验鉴定方法及检测结果的分析与判读。本标准适用于对国境口岸蚊类携带的日本脑炎病毒的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版

3、本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１５５２国境口岸生物因子恐怖事件监测规程ＳＮ／Ｔ２３００—２００９国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法ＷＳ２１４流行性乙型脑炎诊断标准及处理原则ＷＳ２３３微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部，２００６年１月１１日）３术语与定义下列术语和定义适用于本文件。３．１日本脑炎犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊

4、由日本脑炎病毒引起、由蚊传播的中枢神经系统急性传染病，也称流行性乙型脑炎。临床上以突然起病，高热、头痛、呕吐、嗜睡或昏迷、惊厥为特征。４检测对象入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等藏匿和捕获的及口岸区域捕获的蚊虫。５实验室生物安全要求实验室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９、ＷＳ２３３和ＳＮ／Ｔ１５５２执行。６样本采集、处理与转运样本采集、处理与转运参见ＷＳ２１４、ＳＮ／Ｔ２３００—２００９中第７章和附录Ｂ以及可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定执行。１犛犖／犜２７７２—２０

5、１１版权所有·禁止翻制、电子发售７胶体金免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原７．１主要仪器７．１．１生物安全柜。７．１．２可调式微量加样器及塑料尖吸头。７．１．３液氮运输罐、液氮储存罐。７．１．４普通冰箱、超低温冰箱（－８０℃）。７．１．５玻璃研磨器、研磨棒。７．２主要试剂及其制备７．２．１２５狀犿胶体金的制备取１００ｍＬ双蒸水，加热至沸腾。加入１ｍＬ新鲜制备的１％的氯金酸溶液加速搅拌，同时加入新配置的１％的柠檬酸钠溶液１．５ｍＬ，加热２０ｍｉｎ直到溶液变成酒红色后冷却，４℃避光保存。７．２．２免疫层析试纸

6、制备７．２．２．１兔抗日本脑炎病毒ＮＳ１蛋白多克隆抗体标记结束的胶体金溶液以ｐＨ为８．２的０．０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ溶液（含１％ＢＳＡ，５％蔗糖）重悬，浸湿结合垫后３７℃干燥２ｈ。７．２．２．２以浓度为２ｍｇ／ｍＬ的日本脑炎全病毒鼠免疫多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带。７．２．２．３以浓度为１ｍｇ／ｍＬ的羊抗兔ＩｇＧ在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，参数０．１μＬ／ｍｍ划线，检测线与质控线间距离约为７ｍｍ。７．２．２．４将吸收垫、样品垫及处理后的结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后

7、切割层析条，宽度每条４ｍｍ，干燥避光保存待用。７．２．３狆犎为８．２的０．０１犿狅犾／犔犜狉犻狊溶液５０ｍＬ的０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ溶液与２２．９ｍＬ的０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸混匀后，加双蒸水稀释至１００ｍＬ，混匀后将上述溶液与双蒸水按１∶４稀释即为ｐＨ８．２的０．０１ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ溶液。７．２．４狆犎为８．０的５犿犿狅犾／犔犘犅溶液称取磷酸二氢钠２７．８ｇ加双蒸水至１０００ｍＬ溶解即为０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸二氢钠溶液；称取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ）５３．６ｇ加双蒸水至１０００ｍＬ溶解

8、即为０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液。取０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸二氢钠溶液５．３ｍＬ，取０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液９４．７ｍＬ混匀后加双蒸水按１∶１９稀释即可。７．２．５样本处理液ｐＨ为８．０含１％ＮＰ４０的５ｍｍｏｌ／ＬＰＢ溶液。７．３检测步骤７．３．１将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。７．３．２液氮研磨蚊媒组织成粉末状后加适量（５０只批次可加入１ｍＬ）的ｐＨ为８．０的５ｍｍｏｌ／ＬＰＢ液重悬，混匀后于４℃，８０００犵离心５ｍ