SNT2766-2011国境口岸螨类携带汉坦病毒的RT-PCR检测方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７６６—２０１１国境口岸螨类携带汉坦病毒的犚犜犘犆犚检测方法犚犜犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉犺犪狀狋犪狏犻狉狌狊犻狀犿犻狋犲犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７６６—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出

2、入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭天宇、刘佳、任彤、刘艳华、郭敏卓、刘韦华、左曙青、宋锋林。Ⅰ犛犖／犜２７６６—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售国境口岸螨类携带汉坦病毒的犚犜犘犆犚检测方法１范围本标准规定了采用ＲＴＰＣＲ方法检测螨类携带汉坦病毒汉滩型（ＨＴＮ）、汉城型（ＳＥＯ）的检测对象、检测方法、结果报告和实验室生物安全要求。本标准适用于出入境检验检疫机构对螨携带汉坦病毒ＨＴＮ型、ＳＥＯ型的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是

3、必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１５５２国境口岸生物因子恐怖事件监测规程３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１螨类犿犻狋犲狊节肢动物门蛛形纲（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）蜱螨亚纲（Ａｃａｒｉｎａ）中除蜱以外的所有种类的统称。本标准涉及的螨类是指在医学上有重要意义的吸血兼掠食型和吸血型螨类。３．２汉坦病毒犺犪狀狋犪狏犻狉狌狊布尼亚病毒科汉坦病毒属，单股负链ＲＮＡ病毒，在我国主要流行

4、为汉滩型和汉城型，是肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）的病原体。４生物安全措施４．１个人防护采集螨类标本时注意做好个人防护，避免螨虫叮咬。个人防护办法可参照ＳＮ／Ｔ１５５２。４．２实验室生物安全要求样品前处理和病原体检测应在生物安全２级及以上实验室进行。实验室应遵循ＧＢ１９４８９对生物安全２级及以上实验室的生物安全要求。４．３消毒措施实验前后使用有效的紫外灯照射消毒１５ｍｉｎ，紫外灯需要定期检测、更换。实验完毕后所有可用１犛犖／犜２７６６—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售高压消毒的器材均应在实验室内进行高压消毒；不能用高压

5、消毒的器材及实验台面和污染的设备表面用７５％酒精消毒。实验废弃物应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。５器材与试剂５．１器材ＰＣＲ扩增仪、电泳仪及电泳槽、高速台式冷冻离心机、玻璃研磨器或匀浆器、液氮罐、冰箱（温度范围包括２℃～８℃和－２０℃～－８０℃）、生物安全柜、凝胶成像系统、水浴锅、微量移液器及配套带滤芯吸头（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）、离心管（１．５ｍＬ、０．５ｍＬ和０．２ｍＬ）、微波炉。所有耗材（离心管、吸头、玻璃研磨器或匀浆器等）都应不含有ＲＮＡ酶，如不能保证则可用焦碳酸二乙酯（ＤＥ

6、ＰＣ）水或其他清除ＲＮＡ酶的试剂处理。玻璃器皿需在３００℃干烤４ｈ。整个ＲＮＡ制备的操作过程中应戴无粉乳胶手套。５．２常用试剂５．２．１实验用溶液用于ＲＮＡ制备和反转录过程所用的溶液都应保证不含有ＲＮＡ酶，如不能保证需用ＤＥＰＣ处理，以使ＲＮＡ酶失活（但用ＤＥＰＣ处理含有Ｔｒｉｓ的溶液效果不好）。ＤＥＰＣ处理溶液：１００ｍＬ溶液中加入０．２ｍＬＤＥＰＣ，剧烈振荡使ＤＥＰＣ溶于溶液中，３７℃（温箱）处理２４ｈ，高压以灭活残留的ＤＥＰＣ，分装备用。使用ＤＥＰＣ时应戴手套并在通风橱中操作。５．２．２犜犪狇酶及缓冲液－２０℃保

7、存，不要反复冻融或温度剧烈变化。５．２．３磷酸盐缓冲液（犘犅犛）ＮａＣｌ８ｇＫＣｌ０．２ｇＮａ２ＨＰＯ４１．４４ｇＫＨ２ＰＯ４０．２４ｇ加水溶解至１Ｌ，用盐酸调节至ｐＨ７．４。５．２．４犚犖犪狊犲抑制剂（犚犖犪狊犻狀）－２０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。５．２．５犱犖犜犘（１０犿犿狅犾／犔）含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．２．６犜狉犻狕狅犾５．２．７犜犅犈缓冲液（５×浓缩液）或犜犃犈缓冲液（５０×浓缩液）５．２．７．１５×犜犅犈缓冲液配方Ｔｒｉｓ５４．０ｇ２犛犖／犜２７６６—２０１

8、１版权所有·禁止翻制、电子发售硼酸２７．５９ｇＮａ２ＥＤＴＡ３．７２ｇ加水溶解至１Ｌ，调节至ｐＨ８．０。５．２．７．２５０×犜犃犈缓冲液配方Ｔｒｉｓ碱２４２ｇ冰乙酸５７．１ｍＬＮａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ３７．２ｇ加水至１Ｌ，调节至ｐＨ８．０。５．２．８逆转录酶（犃犕犞或犕犕犔犞）－２０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。５．２．９