手足口病rt-pcr检测标准操作程序_tiangen_1_2

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1、河南省CDC传染病预防控制所分子生物学实验室病原检测标准操作程序内部标准手足口病RT-PCR检测标准操作程序(试用)(2008年5月22日第1版,2008年5月29日修改)内部标准编号:检测项目:肠道病毒EV71、CA16,其他肠道病毒检测方法:RT-PCRPCR仪器:Bio-RadiCycler1.检测原理根据已知肠道病毒5’-UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1-VP3基因序列,设计特异性引物(PE、EV71、CA16),通过NestedRT-PCR扩增基因片段,检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大

2、小和配制如下:引物核酸序列(5’–3’)产物长度加DEPC水量(uL)(1OD配制25uM)PE2TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC116bp156PE1ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC180EV71-SGCAGCCCAAAAGAACTTCAC226bp196EV71-AATTTCAGCAGCTTGGAGTGC208CA16-SATTGGTGCTCCCACTACAGC208bp220CA16-ATCAGTGTTGGCAGCTGTAGG2082.应用的范围检测血清、血浆、粪便、咽拭、疱疹液、脑脊液等标本中肠道病毒EV71型和

3、CA16型病毒基因片段。3.标本处理3.1粪便标本处理:3.1.1将1.5mlEppendorf管上标记标本号;theprovisionsofelectricpowerconstructionengineeringqualitysupervisionandquality...2.4.1.1theunitworksacceptancerateof100%,thequalityevaluationofatotalscoreof95orabove;2.4.1.2regulatedWeldingNDTinspection100%,regulatedweldingap

4、assingrateof>99%,andweldbeadappearance;2.4.1.3boilerhydraulic第5页共5页河南省CDC传染病预防控制所分子生物学实验室病原检测标准操作程序内部标准3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul氯仿;3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小,加入标记好的离心管中,剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于-20℃。3.1.4确保拧紧离心管,用机械振荡器剧烈振荡20min。3.1.51500g*(约3500转)离心20分钟。3.1.6将每一份标本上清吸入新1.5mlEppendo

5、rf管中。注意:若上清不清澈,应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物(均简称样品)中提取病毒RNA。3.2咽拭子标本处理咽拭子要在保存液中充分搅动(40下左右)或用机械振荡器剧烈振荡5~10min,以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,然后10000rpm离心20min或4℃静置10min,取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。注意:以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子(均简称样品)中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。3.3提取病毒RNA模板应用RNA提取试剂盒(TianGEN公司产品,C

6、at.No:DP315-R)方法试剂准备:a打开新试剂盒,需将310uLRnase-freeddH2O加入310ugCarrierRNA获得1ug/uL的溶液。溶解后需分装保存于-20℃。(每管分装56uL可做10次提取)。此溶液反复冻融不能超过3次。bCarrierRNA工作液配置:根据样品的数量计算所需裂解液RL和CarrierRNA溶液的体积,将裂解液RL与CarrierRNA溶液颠倒混匀,即得到CarrierRNA工作液。为避免溶液出现气泡现象,请勿使用涡旋振荡。  N×0.56mL=YmL  YmL×10uL/mL=ZuLN-样品数目;Y-裂解液R

7、L溶液体积;Z-需加入CarrierRNA溶液体积注意CarrierRNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中,必须先溶解在Rnase-freeddH2O中,再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8℃最多能保存48小时,最好现用现配。c缓冲液GD、漂洗液RW为浓缩液,第一次使用前加入无水乙醇(试剂瓶上标注的量)混匀,室温可储存1年。-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------提取病毒RNA

8、模板:3.3.1吸取560µl含有CarrierRN

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