对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响

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1、对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响摘要：利用聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳（ｐｃｒ－ｄｇｇｅ）考查了对二氯苯胁迫对湿地土壤细菌群落多样性的影响。通过不同培养时间（４、１８和４５ｄ）和不同培养浓度（１２０、２４０、３６０和６００ｍｇ／ｋｇ）对二氯苯污染下湿地土壤细菌群落基因组的变性梯度凝胶电泳（ｄｇｇｅ）多样性分析。结果表明，各处理下的土壤细菌群落多样性在不同处理时间有明显差异。培养初期对二氯苯对土壤细菌群落抑制作用非常显著，土壤细菌中某些群落的生长受到抑制；不同处理在处理后期差异很小。在土壤培养初期，含对二

2、氯苯２４０ｍｇ／ｋｇ的培养基上出现一条新增条带，为对照和低浓度对二氯苯土壤所没有，说明土壤中存在对二氯苯生长优势菌。关键词：变性梯度凝胶电泳（ｄｇｇｅ）；对二氯苯；湿地土壤细菌菌群；多样性ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（１２０，２４０，３６０ａｎｄ６００ｍｇ／ｋｇ）ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ（４，１８ａｎｄ４５ｄ）ｏｎｗｅｔｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗａ

3、ｓｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇｐｃｒ－ｄｇｇｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅａｃｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅonｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａdifferedａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｉｎｇｔｉｍｅ．ｉｎｅａｒｌｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｅｒｉｏｄ，ｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔ

4、ｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｎｌａｔｅｒｐｅｒｉｏｄｗａｓｌｉｔｔｌｅ．ｉｎｅａｒｌｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｅｒｉｏｄ，ａｎｅｗｍｅｄｉｕｍｂａｎｄｅｍｅｒｇｅｄｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆ２４０ｍｇ／ｋｇｏｆ1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，indicatingｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｐｅｃｉａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｐｅｃｉｅｓresistantto1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｅｘｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅｓｏｉｌ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｇｇｅ；１，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅ

5、ｎｅ；ｗｅｔｌａｎｄｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ土壤微生物在土壤生态中扮演了重要角色［１］，并且参与地球生物生态系统的化学循环，进行污染物质的降解［２，３］。但是由于土壤微生物个体微小、数量众多、土壤环境条件复杂等原因，用常规的分离培养法很难全面有效地评估土壤中微生物群体多样性及环境污染对土壤微生物的影响，极大地限制了人们对土壤微生物的认识［４］。伴随分子生物学技术在环境科学领域的不断应用，不经传统培养，直接从土壤中抽取出土壤微生物总ｄｎａ，利用微生物遗传多样性及区系基因变化

6、来进行污染物环境效应的评价，正在被广泛采用［５－７］。研究排除其他因素，通过提取湿地土壤细菌群落总ｄｎａ，经ｐｃｒ扩增、变性梯度凝胶电泳（ｄｇｇｅ），获得土壤细菌群落１６ｓｒｄｎａｖ３序列分布，以此研究对二氯苯对土壤细菌群落多样性的影响。旨在为更直接更可靠地反映对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的组成情况，评估污染条件下土壤微生物的多样性。１材料与方法１．１供试土壤供试土壤取自盐城海滨湿地土壤，无人为污染。收集１０～２０ｃｍ处新鲜土壤，室内阴干，研磨，充分混匀，过４０目筛。１．２试验设计试验选择２０ｃｍ×４０ｃｍ的塑

7、料桶，桶内加入２ｋｇ土壤，加入适量去离子水，使水面浸过土壤１～２ｃｍ。桶内加入配制好的对二氯苯母液，使桶内对二氯苯浓度分别为０、１２０、２４０、３６０和６００ｍｇ／ｋｇ，每组３次重复，室温２０℃培养。培养过程中不断补水，保证水位高于土壤１～２ｃｍ。分别在第四天、第１８天和第４５天时，从桶内０～１０ｃｍ深度处取土样１０ｇ，采集后的土壤样品－２０℃保存。１．３土壤中细菌群落ｄｎａ的提取２ｇ土壤样品加０．２５ｇ直径０．１ｍｍ玻璃珠，再加２ｍｌ０．１ｍｏｌ／ｌｐｈ８．０磷酸缓冲液，混匀５ｍｉｎ，室温３０００ｒ／ｍｉｎ离心

8、２ｍｉｎ；提上清液，室温１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃上清液，加入３７０μｌ消化液（１００ｍｍｏｌ／ｌｔｒｉｓ－ｈｃl，１００ｍｍｏｌ／ｌｅｄｔａ，１００ｍｍｏｌ／ｌ磷酸钠，１．５ｍｏｌ／ｌｎａｃｌ，１％ｃｔａｂ，ｐｈ８．０），３０μｌ１０％ｓｄｓ，１０μｌ溶菌酶，４６℃水浴１ｈ，加１０μｌ蛋白酶ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）水浴４ｈ；加５００μｌ氯仿、苯酚混合物，混匀１０