大麦条纹花叶病毒诱导大麦cdna文库的构建

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第30卷第4期2008年4月Vo1．30No．4Apr．2008文章编号：1673—9868f2008)04—0078—04M大麦条纹花叶病毒诱导大麦cDNA文库的构建西叫南孙现超，薛杨，安德荣。，青玲，杨水英大1．西南大学植物保护学院，重庆400716；2．中国农业科学院柑橘研究所，重庆400716；学U3．西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌712100学摘要：构报建病毒诱导的寄主植物cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与病毒相互作用寄主因子的前提条件．该自(文以大

2、麦条纹花叶病毒接种大麦，在ELISA跟踪检测的病毒复制和运动初期，采集大麦叶片，用TRIZOL法提取总RNA然，利N用SMART原理进行反转录PCR获得dscDNA，SfiI／XhoI共切后1．1琼脂糖凝胶检测并分段回收dscDNA，分别与SfiI／XhoI共切的载体连接后，共同转化Xblue感受态细胞构建文库．文库的容量和质量检测结果表明：文库的容量为1．27×1O，插入片段大于500bp，集中在1．2kb左右，符合酵母双杂交筛选文库的要求．锄关键词：大麦条纹花叶病毒；诱导；构建；cDNA文库∞中图分类号：E$512

3、．3文献标识码：A植物病毒侵染植物、在植物体内复制和运输除了需要病毒自身编码蛋白之间的相互协助作用外，还需要寄主因子参与j．寻找这些与病毒编码蛋白相互作用的寄主因子，研究其在植物病毒的生命循环过程中所起的作用，是利用基因工程进行抗病育种，从而防治植物病毒的另一条有效途径．6_．其所用的方法主要有Far-western，mRNA差异显示，基因芯片杂交等，而目前报道的与TMV、CMV等多数病毒编码蛋白相互作用的寄主因子多是用酵母双杂交系统获得的．在本文中，我们利用国内分离的BSMV构建了病毒诱导大麦叶片的cDNA文库，为用

4、酵母双杂交的方法从中筛选与BSMV编码蛋白相互作用的寄主因子，寻找来源于寄主系统的抗病毒靶标奠定了基础．1材料方法1．1毒源和种子大麦条纹花叶病毒于2003年3月采自北京郊区大麦田，一80℃冻存；接种大麦种子由西南大学植物保护学院植物病毒学研究室保存．1．2主要试剂RNA提取和纯化试剂盒购自TaKaRa(大连宝生物公司)；反转录试剂盒SuperscriptlI购臼Invitrogen公司；LA—Taq酶购自Clontech公司；引物由Invitrogen公司合成．1．3大麦的病毒诱导和ELISA检测温室内播种大麦，培养

5、至第一叶片10cm左右汁液摩擦接种大麦条纹花叶病毒．接种后每天采集5片叶子进行ELISA检测病毒，于病毒开始复制和在大麦体内运输初期，收集大麦叶片备用．1．4病毒诱导大麦叶片总RNA的提取病毒诱导大麦叶片的总RNA的提取采用北京天根科技生化科技有限公司的RNA提取试剂盒．提取收稿日期：2007—11—12基金项目：重庆市自然科学基金资助项目(CSTC．2007BB1349)；西南大学博士启动基金资助项目(SWUB2006042)作者简介：孙现超(1977一)，男，河南许昌人，博士，副教授，主要从事植物病毒学及微生物源农

6、药研究．维普资讯http://www.cqvip.com第4期孙现超，等：大麦条纹花叶病毒诱导大麦eDNA文库的构建79RNA用紫外分光光度计检测浓度和纯度，并进行琼脂糖甲醛变性电泳分析．1．5dseDNA的获得根据所制备的总RNA浓度，以总RNA(0．5～1g)为模板，用oligo(dT)引物5’。GAGCAACG—CAGAGTACT20—3’，oligo(dG)引物5’一cAAcGcAGAGTAcGcGGG一3’，按BDSMART(tin)反转录试剂盒说明书合成第一链eDNA．取2L第一链eDNA，以5GGTGGT

7、GGCCAT垒AACG—CAGAGTACGC_3’(划线部分酶切位点为Sfi工)为上游引物，5’_ATCGAGCTCGAGCAACGCAGAG—TAD3’(划线部分酶切位点为Xho工)为下游引物，用长距离PCR(LA—Taq)合成试剂盒扩增得到双链cD—NA，PCR反应条件为72℃10rain，95℃1rain；95℃20see，68℃6rain，18个循环；4℃保存．取5LRT-PCR产物在1．1琼脂糖凝胶电泳上鉴定双链eDNA的分布范围．将PCR产物以Sfi工／Xho工共切，酶切产物用DNA回收试剂盒分5OO～80

8、0bp、8001200bp、12OO～2000bp和大于2000bp共4段回收．、1．6dseDNA与载体的连接和文库的转化取2g回收双链eDNA与Sfi工／Xho工共切的pGADT7载体3,ug，于4℃连接24~48h．连接产物经无水乙醇沉淀脱盐后，分2等份，分别电击转化人大肠杆菌X—blue感受态细胞(Stratagene)，