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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1350-2004牛锥虫病补体结合试验方法Protocolofcomplimentfixationtestfortrypanosomiasis2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总层SN/T1350-2004月1J舌本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人:孟广校、徐彪、朱咏梅、生成选。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1350-2004牛锥虫
2、病补体结合试验方法范围本标准规定了牛锥虫病补体结合试验方法。本标准适用于牛锥虫病的抗体检测。2试验材料2.1器材96孔“U"型微量板、10pL^100IL可调移液器、培养箱、水浴锅,15mL尖底离心管、离心机、12mmX75mm试管。2.2试剂2.2.1溶血素:从生物制药厂购买，效价不低于1:1500,2.2.2补体:选择成年雄性豚鼠3只~4只。绝食6h--8h后，从心脏采血，分离新鲜血清保存于普通冰箱中备用。也可以购买冻干补体。2.2.3锥虫病抗原、阳性血清和阴性血清:从生物制品厂购买2.2.4绵羊红细胞悬液的制备:见第A.1章。2.2.5巴比妥缓冲
3、液(简称VBS):见第A.2章。2.2.6溶血标准比色孔的制备:见第A.3章。2.3血清的处理被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清，使用前均需56℃灭活30min.3预备试验3.1溶血素效价的测定3.1.1配制1:20的补体。3.1.2溶血素稀释:将溶血素用VBS做1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:500,1:3000,1，3500,1’4000,1，4500,1，5000稀释。3.1.3溶血素效价测定:取96孔“U"型微量板，按表1中各成分的量加人务孔中。表1溶血素效价测定表单位为微升管号成分二12345678910卜血素补叫
4、红细胞溶血素500X100ox1500欠2000X2500X又nn门x介气nn丫4000义4500X5000只1:1001稀释度卜血，2525252525252525252525VBS5050SO505050505050507575100怂252525252525252525250253%红252525252525252525125252525细胞液SN/T1350-2004封板后于370C-38℃放置30min,500g离心5min，检查结果。3.1.4溶血素效价的判定:在溶血素对照全部溶血、补体对照和红细胞对照不溶血的情况下，参照标准比色孔(见第A
5、.3章)，完全溶血的溶血素的最高稀释倍数即为溶血素稀释度，一般溶血素稀释度为1，2000，在试验中使用2个溶血单位的溶血素。3.2补体效价的滴定3.2.1补体用VBS作系3rj稀释，分别为1:10,1:20,1:30,1:40,1:60,1:80,1!100,1‘150,1:200,1.300........3.2.2取96孔“U"型微量板，按表2滴定补体效价。表2补体效价测定表(结果举例)单位为微升孔号Iz34s67ss10补体稀释度1:101:201:301:401x60I:801:1001:1501,2001:300补体2525252525252
6、5252525血清25252525252525252525阳第一列抗原25252525252525252525性血血清25252525252525252525第二列清VBS25252525252525252525血清25252525252525252525阴第一列抗原25252525252525252525性血血清25252525252525252525第二列清VRS25252525252525252525震荡混匀后，于37℃保温15min,2单位溶血家252525252525252525253%红细胞25252525252525252525震荡摇匀封
7、板后，于37℃保温0min，以500g离心5mm,参照标准比色孔(见第A.3章)观察结果.阳性血清加抗原不溶不溶不溶不溶不溶不溶不溶不溶不溶不溶阳性血清未加抗原全溶全溶全溶全溶全溶部溶部溶不溶不溶不溶阴性血清加抗原全溶全溶全溶全溶全溶部溶部溶不溶不溶不溶阴性血清未加抗原全溶全溶全溶全溶全溶部溶部溶不溶不溶不溶3.2.3补体效价的判定:补体效价是指阳性血清加抗原的孔完全不溶血，阳性血清未加抗原的孔以及阴性血清无论有无抗原的孔完全溶血所需补体最小的量即为一个单位补体。本例中一个单位补体为1:60稀释度的补体，正式试验时使用2个单位的补体，即1，30稀释的补
8、体。3.3抗原效价的测定3.3.1取96孔“U"型微量板，向各孔中分别加人VBS25叮3.3.
