SNT1315-2010牛地方流行性白血病检疫技术规范.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１５—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３牛地方流行性白血病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犲狀狕狅狅狋犻犮犫狅狏犻狀犲犾犲狌犽狅狊犻狊２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１３１５—２０１０前言本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３《牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３相比，主要变化如下：———标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》；———增加了

2、临床诊断部分；———实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：———对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善。本标准的附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赖平安、高志强、吴丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１５—２００３。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜１３１５—２０１０牛地方流

3、行性白血病检疫技术规范１范围本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１９１７牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程３缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１犈犅犔牛地方流行性白血病。３．２犅犔犞www.

4、bzfxw.com牛白血病病毒。３．３犉犅犔胎牛肺。３．４犚犐犃放射性免疫试验。３．５犘犆犚聚合酶链反应。３．６犃犌犐犇琼脂凝胶免疫扩散。３．７犈犔犐犛犃酶联免疫吸附试验。４临床诊断４．１流行病学牛感染ＢＬＶ后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自１８７８年发现于德国以来，目前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的１犛犖／犜１３１５—２０１０日本也因输入性传播导致该病在全国蔓延。４．２临床症状牛白血病的潜伏期较长，可达４年～５年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病

5、抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。４．３病理变化感染ＢＬＶ后，病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。５实验室诊断５．１病原分离及鉴定５．１．１原理ＢＬＶ是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是Ｂ淋巴细胞。ＢＬＶ不仅以前病毒的形式存在于感染牛

6、的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等）中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或ＢＬＶ抗原测定法鉴定。也可直接用ＰＣＲ检查外周血和肿瘤中存在的ＢＬＶ前病毒ＤＮＡ。５．１．２材料准备５．１．２．１器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（－２０℃保存血清，－７０℃保存种毒），无菌９６孔细胞培养板，微量可调移液器（５０μＬ、１００μＬ），微量滴头，吸管（５ｍＬ、１０ｍＬ）。www.bzfxw.com５．１．２．２试剂：淋巴细胞分离液、２０％胎牛血清

7、的ＭＥＭ培养液和细胞分散液配制见附录Ａ。５．１．２．３胎牛肺细胞：无菌采取出生犊牛肺，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置３７℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。５．１．３样品制备５．１．３．１样品采集用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放入４℃冰箱保存，在２４ｈ内送到实验室。５．１．３．２样品处理取１．５ｍＬ抗凝血，轻轻加入等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层

8、较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放入另一离心管中，以ＰＢＳ洗涤后备用。５．１．４病毒分离取５．１．３．２得到的淋巴细胞与２×１０６ＦＢＬ细胞在４０ｍＬ含２０％胎牛血清的ＭＥＭ中共同培养，置于３７℃５％二氧化碳培养箱，逐日观察细