蛋白质和氨基酸的呈色反应实验讲义

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1、实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应一、目的要求(1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。(2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。二、原理㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。1．双缩眠反应当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多

2、个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是：3．茚三酮反应蛋白质、多糖和各种氨基酸

3、具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。三、器材与试剂㈠器材⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管㈡试剂和材料⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3⒌卵清蛋白溶液（蛋清：水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液四、操作步骤1.双缩脲反应（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。试管冷却后，加入约

4、1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。（2）另取一支试管，加卵清蛋白溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及1％CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。2.Salkowski(1888)蛋白黄色反应（1）取一支试管，加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO33－4滴，加热，冷却后再加入10％NaOH溶液5滴，观察颜色变化。（2）取一支试管，用0.5％苯酚溶液代替蛋白质溶液，重复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加

5、入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。3.茚三酮反应（1）取2支试管分别加入卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加入0.5ml0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热1－2分钟，冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。（2）在一块滤纸片上滴加1滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1％的茚三酮－乙醇溶液显色，用电吹风吹开显色。观察出现的紫红色斑点。五、实验记录以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“＋”、“＋＋”和“＋＋＋”表明颜色深浅程度。六、思考题”1综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法

6、的特点和用途。2．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。能对此作何结论?3．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是。为什么?4．是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果，为什么?是否大部分蛋白质呈现阳性结果。为什么?实验二蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法一、目的要求学习考马斯亮蓝(CoomssieBrilliantB1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理浓度的快速。灵敏的方法。考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式．红色和蓝色。

7、它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsnderWaals’bond)结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’slaw)。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量．蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质—染料复合物具有很高的消光系数．使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0．

8、275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是1—10ug蛋白质。此反应重复性好．精确度高，线性关系好．标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低．但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研