NF-κB乙酰化介导低氧条件下DDAH1基因的表达调

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1、分类号：R394单位代码：10159密级：公开学号：201520011硕士学位论文中文题目：NF-κB乙酰化介导低氧条件下DDAH1基因的表达调控英文题目：AcetylationofNF-κBmediatestheregulationofDDAH1geneexpressionunderhypoxicconditions论文作者：陈凯师指导教师：李英慧副教授学科专业：遗传学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文NF-κB乙酰化介导低氧条件下DDAH1基因的表达调控AcetylationofNF-κB

2、mediatestheregulationofDDAH1geneexpressionunderhypoxicconditions论文作者陈凯师指导教师李英慧副教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科遗传学研究方向心血管疾病的表观遗传学论文起止时间2017年9月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要前言：心脑血管疾病（Cardio-cerebrovasculardisease，CCVD）是一类由遗传和环境共同作用导致的多因素

3、疾病，已成为全球较常见的死因。血管的病理学改变如血管壁血脂的沉积、慢性的炎症反应和血管平滑肌的增生等，会导致局部组织的缺血缺氧。有研究发现缺氧可以导致舒血管因子一氧化氮（NO）产生量的增加。NO是调节血管舒缩功能的主要调节剂，在血管内环境稳定中起关键作用，它由一氧化氮合酶（NOS）酶产生。非对称性二甲基精氨酸（Asymmetricdimethylarginine，ADMA）是一种内源性NOS抑制剂，是心血管死亡率和慢性肾脏疾病进展的危险因素。循环中的ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶（Dimethyla

4、rgininedimethylaminohydrolase，DDAH）降解。DDAH有两种亚型，包括DDAH1和DDAH2，研究显示DDAH1是降解ADMA的关键酶，并有研究表明DDAH1启动子区存在着几个脂类代谢和炎症相关的转录因子作用位点。NF-κB是一种参与介导细胞炎症反应的核转录因子，缺氧会在不同程度上引起细胞组织的炎症反应，同时低氧条件下NF-κB与靶DNA结合并引发了一系列促炎的基因的转录。NF-κB乙酰化增强其与DNA之间的结合，促进基因的转录，本课题组前期已经证实NF-κB通过乙酰化参与nN

5、OS和DDAH2基因的表达调控。本研究中，通过JASPAR等生物信息学软件预测NF-κB在DDAH1启动子区结合位点，用CoCl2模拟低氧条件，拟通过相关分子生物学技术检测细胞中DDAH1的表达水平及转录因子结合情况；同时，用TSA刺激SH-SY-5Y和HEK293细胞促进相关蛋白发生乙酰化，鉴定NF-κB在低氧条件下对DDAH1的调节机制。阐明一种心脑血管疾病发生的可能分子机制，并可能为心脑血管疾病的治疗提供一种新的治疗策略。材料与方法：一、实验材料1、人胚肾细胞系HEK2932、人神经母细胞瘤细胞系SH

6、-SY-5Y3、Real-timePCR及Western印迹杂交相关试剂4、免疫沉淀相关试剂5、荧光素酶载体构建及检测相关试剂6、ChIP和DNA结合实验相关试剂Ⅰ中国医科大学硕士学位论文二、实验方法1、分别用CoCl2（模拟低氧）、TSA（抑制去乙酰化酶）及低氧和乙酰化联合作用处理HEK293、SH-SY-5Y细胞系，应用Real-timePCR及Western印迹杂交检测不同时间点的DDAH1表达水平；2、构建荧光素酶表达载体，分别检测正常情况下启动子活性及低氧、乙酰化、低氧和乙酰化联合作用对启动子活性

7、的影响；3、应用ChIP及DNA结合实验分别验证NF-κB与DDAH1启动子区体内和体外结合情况；4、应用IP及Western印迹杂交实验，检测低氧、乙酰化及低氧和乙酰化联合作用下SH-SY-5Y细胞系中NF-κB的乙酰化水平。实验结果：1、在HEK293、SH-SY-5Y细胞系中，用CoCl2（100µM）模拟低氧条件，应用Real-timePCR及Western印迹杂交实验，检测正常细胞及低氧处理后6h、12h和24hDDAH1的表达水平，结果显示低氧能上调DDAH1的mRNA和蛋白表达水平。2、JAS

8、PAR和ALIBABA2等软件预测结果显示：在DDAH1的启动子区存在NF-κB结合位点，位于DDAH1启动子区翻译起始位点上游-1237~-1228位置，提示DDAH1可能是NF-κB潜在靶基因。3、双荧光素酶报告基因实验结果显示：与pGL-3及pGL-1194组相比，pGL-1291组荧光素酶活性升高（P<0.05）；低氧、乙酰化及二者联合处理细胞后，pGL-1291组荧光素酶活性均显著上升（P<0.05）。