原位杂交演示实验讲义

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1、原位杂交演示实验讲义一、组织标本以及器皿的处理1.实验动物心脏灌流，一方面是除去血液中物质的干扰，另一方面可以更好的保持组织形态。2.玻璃器皿常规洗净后应用RNA酶抑制剂，如0.1%的DEPC水溶液，浸泡处理若干小时，然后高压灭菌除去DEPC，最后180℃烘烤4h。3.载玻片预处理：常规处理步骤后，180℃烘烤4h，然后APES粘片。4.冰冻切片制备。二、RNA探针制备流程1.总RNA的提取以及反转录制备cDNA：（1）将台式离心机置于4度冰箱预冷；（2）匀浆器头使用前后须作如下处理：a.3％H2O2浸泡

2、15-30min；b.灭菌水冲洗2次，甩净，晾干；c.匀浆；d.匀浆后用浓度不高于0.5％的SDS洗液清洗，再用灭菌水冲洗至无白沫；e.无水乙醇浸泡，干燥，防止生锈；（3）取1mlTIRZOL加入小试管中，同时加入组织块100mg。若组织块大于100mg，使两者比例保持为1ml：100mg；（4）匀浆。匀浆时应将匀浆器转速调到最大，每次转10秒钟，转多次，以防止匀浆器及其内液体过热，导致RNA降解；（5）EP管中匀浆液在室温下放置5min，4度12000×g离心10min；（6）按每1mlTRIZOL液加

3、入0.2ml氯仿，用力振荡15s，混匀后室温放置2-3min，4度12000×g离心15min；（7）将上清液移入另一DEPC处理过的EP管中，按每1mlTRIZOL液0.5ml异丙醇的比例加异丙醇，混匀，室温放置10min；（8）4度12000×g离心10min后，去净上清；（9）75％乙醇洗涤沉淀，4度7500×g离心5min，然后去掉乙醇；（10）加适量（40ul）DEPC水或去离子甲酰胺溶RNA，用分光度计测OD260值，计算RNA含量。RNA含量（ug/ul）＝OD260×40×稀释倍数/100

4、0。（11）根据TaKaRaBcaBESTTMRNAPCRKitVer.1.1试剂盒方法反应体系2×Buffer10ul25mMMgSO44uldNTPMixture1ulRnaseIn0.5ulBcaBESTPolymerase1ulOligodTPrimer1ul（或RandomPrimer1ul）（或特异的下游引物1ul）实验样品（总RNA不大于1ug）1ulRnaseFreedH2O1.5ul反应条件：65度×1min->30度×5min->15min～30min内匀速升温到65度->65度×15

5、min->98度×5min->5度×5min2.PCR及其产物的回收：使用设计的特异引物，以总cDNA为模板进行PCR扩增。100ul反应体系蒸馏水66ul（66％）10×Buffer10ul（10％）dNTP8ul（8％）酶1ul（1％）引物-15ul（5%）引物-25ul（5％）模板5ul（5％）大量扩增、电泳后，按小量胶回收试剂盒说明进行胶回收。3.PCR产物与载体的连接：根据PromegapGEM－TVectorSystem试剂盒方法体系10μL2×Buffer5μLT-Vector1μLDNA2

6、5ng/1μLH2O2μL连接酶1μL25℃1-2h4.转化重组质粒以及重组质粒的初步鉴定：（1）将感受态细胞从-80℃冰箱取出，迅速解冻放于冰水中，加入已连接质粒，轻混匀，冰上放置30min；（2）42℃水浴90s；（3）快速移入冰水中，放置30min；（4）加4倍菌液体积的LB液体培养基，混匀，封口,37℃振荡培养30-60min；（5）取300μL用涂布棒均匀涂于Amp+平板上，待平板菌液干后，用封口膜封好，37℃倒置过夜培养14-16h；（6）挑单菌落于10mlAMP+LB液体培养基，37℃200

7、r/min培养5-8h；（7）菌液测序：检测插入片段有无突变以及判断插入片段的方向；（8）使用小量质粒回收试剂盒从菌液中提取质粒；5.RNA探针标记：（1）以质粒为模板，T7、SP6为引物进行大量扩增目的片段200μL，胶回收PCR产物；（2）根据RocheDIGRNALabelingKit(SP6/T7)，反应体系如下：cDNAxμL（1μg）DEPC水13-xμLBuffer2μLT7或SP6酶2μLNTPlabelingMixture2μLProtectorRNaseinhibitor1μL上述溶液

8、混匀后离心37℃2h（3）2μL0.2MEDTA(pH8.0)终止反应2μLLiCl50μL100%乙醇-20℃过夜。（4）13000rpm4℃离心15min弃上清（5）100μL70%乙醇重悬沉淀（6）13000rpm4℃离心10min（7）晾干沉淀100μLDEPC水溶解分装于-80℃冰箱保存。三、原位杂交实验步骤杂交前：1.50°C（展片台）2min2.4%PFA1h3.PBS´35min4.1%Triton-100（3