胃癌风险相关差异甲基化—差异表达基因筛选及验证研究

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分类号：R730.231单位代码：10159密级：公开学号：201420603硕士学位论文中文题目：胃癌风险相关差异甲基化-差异表达基因筛选及验证研究英文题目：Bioinformatics-BasedIdentificationofMethylated-DifferentiallyExpressedGenesandRelatedPathwaysinGastricCancer论文作者：李浩指导教师：孙丽萍教授学科专业：肿瘤学完成时间：2018年3月 中国医科大学硕士学位论文胃癌风险相关差异甲基化-差异表达基因筛选及验证研究Bioinformatics-BasedIdentificationofMethylated-DifferentiallyExpressedGenesandRelatedPathwaysinGastricCancer论文作者李浩指导教师孙丽萍教授申请学位医学硕士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科肿瘤学研究方向胃癌早期诊断基础研究论文起止时间2016年3月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月 中国医科大学硕士学位论文摘要目的：表观遗传学改变包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA调控和染色质重塑等，可以通过影响基因突变、表达调控、细胞增殖等调节基因转录活性和表达。抑癌基因启动子区高甲基化导致基因失活是表观遗传变异的重要机制之一，与肿瘤发生、发展密切相关。多项研究报道抑癌基因如P16、RASSF1A、Runx3、PCDH10、hMLH1等启动子区甲基化与基因表达沉默密切相关，参与胃癌发生及进展。目前，用于差异性甲基化、差异性表达基因筛选的方法有多种，其中生物信息学分析是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学问题。相较于基础生物研究，生物信息学研究是在全基因组研究基础上得到的数据结果，更为宏观。基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）是生物信息学分析主要的媒介工具，测序原理为杂交测序方法。其中，甲基化芯片使全基因组甲基化分析成为可能，基因表达谱芯片则可以分析全基因组中肿瘤相关差异表达基因。以往利用基因芯片进行的研究，通常只是单一的甲基化谱或基因表达谱分析，或仅聚焦于某一个基因的甲基化与表达间关联分析，而将二者相结合并经一致性分析并验证，则有望明确胃癌发生发展过程中真正受甲基化调控的基因，并以此为基础深入胃癌表观遗传调控研究。本研究拟利用生物信息学方法，通过甲基化芯片和表达谱芯片联合分析筛选胃癌特异性差异甲基化-差异表达基因，经富集分析和蛋白相互作用分析获得核心基因并验证；进一步，利用胃癌及癌旁对照组织样本检测明确候选核心基因甲基化-基因表达相关性及其与胃癌风险的关系。方法：选取GEO数据库里面的表达谱芯片（GSE13911andGSE29272）和甲基化芯片（GSE25869andGSE30601），利用GEO2R进行胃癌特异性差异甲基化-差异表达基因筛选，利用GO分析和通路分析进行富集分析。使用STRING数据库对差异基因进行蛋白相互作用分析，在相互作用网络中寻找其核心基因，并经TCGA（肿瘤基因图谱，TheCancerGenomeAtlas）数据库和小样本组织验证。进一步，针对核心基因生长抑素(somatostatin,SST)，利用139例胃癌癌灶（GC）和远端正常（NOR）胃黏膜组织进行扩大样本组织验证。采用BGS测序法检测SST基因启动子区甲基化，Real-timeRT-PCR法检测mRNA表达。结果：联合筛选得到胃癌风险相关的445个高甲基化-低表达基因（HyperLGs），主要富集于系统过程和通道活性调节；129个低甲基化-高表达基因（HypoHGs），I 中国医科大学硕士学位论文主要富集于细胞粘附、细胞增殖和蛋白质结合过程。通路分析显示HyperLGs与神经活性配体-受体相互作用和钙信号传导途径相关，而HypoHGs与癌症通路相关。在蛋白相互作用网络中，经TCGA和小样本组织检测验证后，CASR、CXCL12和SST被鉴定为具有显著差异的核心基因。扩大样本检测后，发现胃癌与癌旁对照组织中，SST启动子区12、15、16、23和24位点甲基化率存在差异，SST基因表达差异具有统计学意义，SST启动子区甲基化与基因表达关系存在弱相关。甲基化与病理参数没有显著性差异。结论：差异甲基化-差异表达基因联合分析有助于解析胃癌发生发展的表观遗传调控机制。SST启动子区特异位点高甲基化及其介导的基因表达沉默具有胃癌预警价值。关键词：胃癌；生物信息分析；甲基化；STRING；SSTII 中国医科大学硕士学位论文AbstractObjective:EpigeneticchangesincludeDNAmethylation,histonemodification,RNAregulationandchromatinremodeling,whichcanregulategenetranscriptionandexpressiontoaffectgenemutation,expressionregulation,cellproliferation,andsoon.Themethylationofthepromoterregionisoneoftheimportantmechanismsofepigeneticvariation,whichiscloselyrelatedtotumorigenesisanddevelopment.ManystudieshavereportedthemethylationofsuppressorgenessuchasP16,RASSF1A,Runx3,PCDH10,hMLH1wereiscloselyrelatedtogeneexpressionsilenceparticipatinginoccurrenceanddevelopmentofgastriccancer.Atpresent,therearemanymethodsfordifferentiallymethylatedanddifferentiallyexpressedgenes,ofwhichbioinformaticsanalysisistostudybiologybyusingthemethodsofappliedmathematics,informatics,statisticsandcomputerscience.Comparedwiththebasicbiologicalresearch,bioinformaticsresearchisbasedongenomewidedatatoobtaintheresearchresults,whichismoremacro.WiththeimplementationoftheHumanGenomeProjectandtherapiddevelopmentofrelateddisciplinesinmolecularbiology,genesequencedataarerapidlygrowingatanunprecedentedrateandmoreandmoregenomesequencesofanimals,plantsandmicroorganismsaredetermined.Genechipsarethemainmediatoolsforbioinformaticsanalysis.Thesequencingprincipleisthehybridizationsequencingmethod,thatis,themethodofnucleicacidsequencedeterminationbyhybridizationwithasetofknownnucleicacidprobes,Thesurfaceofthesubstrateisimmobilizedwithaprobewhosetargetnucleotideisknown.Amongthem,methylatedchipsmakegenome-widemethylationanalysispossible,andgeneexpressionprofilingchipscananalyzetumor-relateddifferentiallyexpressedgenesinthewholegenome.Inthepast,genechip-basedresearchwasusuallyonlyasinglemethylationprofileorgeneexpressionprofiling,oronlyfocusingonthemethylationandexpressionassociationanalysisofacertaingene,andthetwowerecombinedandanalyzedbyconsensusAndverifythatitisexpectedtoclearthegenesisanddevelopmentofgastriccancerrealIII 中国医科大学硕士学位论文methylationregulationofgenes,andasabasisforthestudyofepigeneticregulationofgastriccancer.Inthisstudy,methylated-differentiallyexpressedgenes(MDEGs)wereobtainedbydetectingmethylatedmicroarrayandmicroarraytogether.Throughtheenrichmentanalysis,wecangetthemaingotermsandpathwaysofMDEGs.TheProtein–proteininteraction(PPI)analysiswasobtainedamongMDEGs.Hubgenesisobtainedthroughtheirinteraction.Thenweverifiedthehubgene.Furthermore,weselectedoneofthehubgenes,SSTtodetectthemethylationandexpressionbetweengastriccanceranditsnormaltissues.Methods:Expressionprofiling(GSE13911,GSE29272)andmethylationprofiling(GSE25869,GSE30601)datawereobtainedfromGEODataSets.DifferentiallyexpressedgenesanddifferentiallymethylatedgeneswereidentifiedusingGEO2R.GeneontologyandpathwayenrichmentanalyseswereperformedfortheMDEGs.Protein–proteininteraction(PPI)networkswereestablishedbySTRINGandCytoscape.AnalysisofmodulesinthePPInetworkswasperformedusingMCODE.Furtherly,thehubgenesderivedfromthePPInetworkswereverifiedbyTheCancerGenomeAtlas(TCGA)databaseandhumantissues,withmethylation-specificPCR(MSP)forgenesmethylationandreal-timeq-PCRforgenesexpression.Thisstudyincluded139gastriccancer(GC)patientsunderwentsurgicaltreatmentfromtheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversitywithtumortissuesanddistalnormalmucosa(NOR)ThemRNAexpressionsofSSTingastricmucosaweredetectedbyReal-timePCR.Directbisulfitesequencing(BGS)wasusedtodetectthemethylationlevelofSSTpromoterregionaftersulfitemodification.Results:Atotalof445geneswereidentifiedashypermethylated,lowlyexpressedgenes(Hyper-LGs),whichwereenrichedinregulationofsystemprocessandchannelactivity.Atotalof129geneswereidentifiedashypomethylated,highlyexpressedgenes(Hypo-HGs),whichwereinvolvedincelladhesion,cellproliferation,andproteinbinding.PathwayanalysisshowedthatHyper-LGswereassociatedwithneuroactiveligand-receptorinteractionandcalciumsignalingpathway,whileHypo-HGswereenrichedinIV 中国医科大学硕士学位论文pathwaysincancer.InthePPInetworks,afterverificationbyTCGAanalysisandhumantissuedetection,CASR,CXCL12andSSTwereidentifiedassignificantlydifferenthubgenes.AftertissuevalidationexpressionofSSTbetweencancerandadjacentnormalshoweddifferences.TheaveragemethylationrateandhypermethylationsitesofSSTwerenotdifferent.Methylationratesofmethylationsites12,15,16,23and24ofSSTshoweddifferentConclution:MDEGanalysishelptounderstandtheepigeneticregulationmechanismsinvolvedinthedevelopmentandprogressionofgastriccancer.Thehubgeneshavepredictiveandprognosticvalueasmethylation-basedbiomarkersfortheprecisediagnosisandtreatmentofgastriccancer.Keywords:gastriccancer,bioinformatics,methylation,STRING,SSTV 中国医科大学硕士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称MDEGsmethylated-differentiallyexpressedgenes差异甲基化差异表达基因PPIProtein–proteininteraction蛋白质相互作用TCGATheCancerGenomeAtlas肿瘤基因图谱GCGastriccacner胃癌NORdistalnormalmucosa远端正常组织BGSbisulfitesequencing亚硫酸氢盐测序Hyper-LGshypermethylated,lowlyexpressedgenes高甲基化低表达基因Hypo-HGshypomethylated,highlyexpressedgenes低甲基化高表达基因SSTSomatostatins生长抑素VI 中国医科大学硕士学位论文目录摘要……………………………………………………………………………IAbstract…………………………………………………………………………III英文缩略语……………………………………………………………………VI1前言…………………………………………………………………………12材料与方法…………………………………………………………………22.1主要试剂和仪器……………………………………………………….22.2研究对象………………………………………………………………22.3实验方法………………………………………………………………33结果…………………………………………………………………………83.1胃癌特异性差异甲基化-差异表达基因筛选…………………………83.1.1差异甲基化-差异表达基因筛选……………………………83.1.2差异甲基化-差异表达基因富集分析…………………………103.1.3差异甲基化-表达基因蛋白相互作用网络构建和核心基因选择123.1.4模型分析…………………………………………………………133.1.5TCGA数据库和小样本组织验证…………………………………143.2SST启动子区甲基化及基因表达与胃癌风险相关性分析…………153.2.1SST启动子区甲基化水平及特异性位点……………………163.2.2SST基因mRNA水平表达………………………………………164.讨论………………………………………………………………………15本研究创新性的自我评价………………………………………………………21参考文献…………………………………………………………………………23文献综述…………………………………………………………………………26攻读学位期间取得的研究成果…………………………………………………39致谢………………………………………………………………………………40个人简历…………………………………………………………………………41VII 中国医科大学硕士学位论文胃癌风险相关差异甲基化-差异表达基因筛选及验证研究1前言胃癌是世界范围内最重要的恶性肿瘤之一，我国胃癌发病率为22.7/10万，2015年新发病例为42万例，居全球首位[1]。胃癌发生发展是一个多因素、多阶段、多基因参与复杂过程，不仅与基因突变和缺失等核苷酸序列变异有关，还与表观遗传学调控失衡有关。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程[2]。然而，并非所有的甲基化改变都具有调控基因表达功能。Zouridis等报道，44%的基因CpGs岛可检测到胃癌特异性甲基化改变（包括高甲基化和低甲基化），其中仅25%的甲基化改变与基因表达显著相关。约78％的甲基化与基因表达呈显著负相关，少数的正相关则与CpG位点与传统转录起始位点举例和其在基因组中定位有关[3]，因此，联合进行差异甲基化-差异表达基因（differentiallymethylated,differentialexpressedgenes，MDEGs）分析，筛选并验证胃癌相关MDEGs，对于阐明胃癌发生发展的表观遗传调控机制具有重要意义。目前，用于差异性甲基化、差异性表达基因筛选的方法有多种，其中生物信息学(bioinformatics)分析是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学问题[4]。相较于基础生物研究，生物信息学研究是在全基因组研究基础上得到的数据结果，其结果更加的宏观。基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长，随着人类基因组计划（Humangenomeproject）的实施及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定。基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）是生物信息学分析主要的媒介工具，测序原理为杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针[5]。其中，甲基化芯片使全基因组甲基化分析成为可能[6]，基因表达谱芯片则可以分析全基因组中胃癌相关差异表达基因[7]。以往利用基因芯片进行的研究，通常只是单一的甲基化谱或基因表达谱分析，1 中国医科大学硕士学位论文或仅聚焦于某一个基因的甲基化与表达间关联分析，而将二者相结合并经一致性分析并验证，则有望明确胃癌发生发展过程中真正受甲基化调控的基因，并以此为基础开展胃癌表观遗传调控研究。综上，本研究拟利用生物信息学方法，通过甲基化芯片和表达谱芯片联合分析筛选胃癌特异性差异甲基化-差异表达基因，经富集分析和蛋白相互作用分析获得核心基因并验证；进一步，利用胃癌及癌旁对照组织样本检测明确候选核心基因甲基化-基因表达相关性及其与胃癌风险的关系。期望通过本研究为阐明胃癌发生的表观遗传机制提供有价值的线索，为胃癌筛查早诊提供适用性标志。2材料与方法2.1主要试剂和仪器2.1.1主要试剂氯仿Tris平衡酚ZymoDNAMethylation-GoldkitHotStartTaqTakara2.0Version培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP430）动物组织总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP431）SYBR®PremixExTaqTMⅡ，Takara公司2kpDNAladderMarker,Fermentas公司TaqpolymeraseSinoBioE001-02BdNTP，Takara公司Primer,华大基因公司2.2.2主要仪器超低温冰箱多功能冷冻离心机GS-15R(美国Bekman公司)超净工作台，苏州AirTech公司PCR仪，德国Eppendorf公司2 中国医科大学硕士学位论文Real-timePCR仪，德国Eppendorf公司电泳仪，Bio-Rad公司凝胶成像系统，美国Bio-rad公司紫外/可见分光光度计DU640，微量加样器及枪头2.2研究对象139例研究对象来自2012年8月-2015年12月中国医科大学附属第一医院接受手术治疗的胃癌患者，其中男性52例、女性28例，平均年龄59岁（25-83岁），所有病例均经病理组织学检查明确诊断。收集其胃癌（GC）及远端正常（NOR）新鲜胃黏膜组织，-80℃冰箱冻存待用。本研究经过中国医科大学附属第一附属医院伦理委员会批准，全部研究对象均签署知情同意。2.3实验方法2.3.1差异甲基化-差异表达基因分析1)进入GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)检索相关芯片信息2)点击芯片信息中的GEO2R；3)根据样本注释把样本分为癌组和正常组；4)分析芯片中的所有结果，以矫正P值<0.01和|logFC|>1作为筛选条件。重复的和不特异的探针将被去除。5)依次分析甲基化芯片和表达芯片6)利用差异的高甲基化基因和差异的低表达基因进行重合匹配。同时利用差异的低甲基化基因和差异的高表达基因进行重合匹配。最终得到高甲基化低表达基因和低甲基化高表达基因。2.3.2差异基因富集分析1).打开网站后DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）,点击startanalysis;2)在左边的输入框里，分别输入高甲基化低表达基因和低甲基化高表达基因。3)选择数据类型—“GENE_SYMBOL”4)选择GeneList5)提交，点击submit6)选择物种为选择人类3 中国医科大学硕士学位论文7)选择“FunctionalAnnotationChart”即可得到差异基因的富集分析2.3.3蛋白相互作用分析及核心基因选择1)打开STRING数据库(string-db.org)2)选择“MultipleProteins”，分别输入高甲基化低表达基因和低甲基化高表达基因。3)下载TSV格式的蛋白网络图，导入cytoscape。4)利用其中的插件“Centiscape2.2”计算其基因连接数，选择连接数>10的为核心基因2.3.4核心基因验证分析1)打开oncomine数据库(oncomine.org)[8]2)输入核心基因，选择TCGA数据库，进行差异表达验证3)打开MethHC数据库[9](http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)4)输入核心基因，验证是其甲基化水平在TCGA数据库是否有差异2.3.5胃黏膜组织和胃上皮细胞株RNA提取、cDNA合成胃黏膜组织及胃上皮细胞株总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书操作。1)胃黏膜组织RNA提取a)取60mg左右新鲜胃黏膜组织于1.5mlEP管中，眼科剪刀剪碎，1×PBS洗两次，加入1mLTrizol试剂，轻轻混匀，室温静置10min.b)加入0.2ml氯仿，混匀15s，室温静置5min.12000r/min4℃离心15min后取出，吸取上清。c)继续加入1ml异丙醇,室温放置1-2h；12000r/min4℃离心10min.d)弃去上清，加入75%乙醇。10000r/min4℃离心5min.e)弃去上清，室温放置干燥15-20min.加适量ddH2O。f)NANODROP方法检测总RNA浓度。2)胃上皮细胞株总RNA提取25cm2培养瓶细胞生长至80%融合度时，移至1.5mlEP管中，提取步骤同前。3)cDNA合成4 中国医科大学硕士学位论文采用FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN，KR106），按说明书操作。在0.5mlEP管加入：5×PrimeScriptRTMasterMix2ul,总RNA500ng,加ddH2O补足10ul。轻柔混匀之后，37℃15min，85℃5s进行PCR反应：产物4℃保存。2.3.6核心基因mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR法（real-timefluorescentquantitativePCR）（TaKaRa，SYBR®PremixExTaqTMⅡ）检测核心基因mRNA表达水平。qRCR反应反应体系：以胃黏膜组织或胃癌细胞cDNA为模板，GAPDH为内参，反应体系如下：试剂体积(ul)SYBRII10上下游引物0.8模板cDNA1加ddH2O至20μL反应条件：预变性：95℃30s变性：95℃15s退火：56℃30s40cyc延伸：72℃30s终止：4℃2.3.7胃黏膜组织与胃上皮细胞DNA提取采用酚氯仿法提取组织和细胞DNA。1)取米粒大小新鲜冰冻组织或适量细胞，眼科剪刀将组织剪碎,细胞不用处理。2)加400ulTE,25ul,10%SDS，10ul20mg/mlPK酶，混匀，37℃水浴锅中过夜。3)水浴锅取出后，加等体积酚，震荡15min,4℃，12000rmin离心10min。4)吸上清，加等体积酚：氯仿=1:1，震荡15min,4℃12000r/min离心10min。5)吸上清，加等体积氯仿，震荡15min,4℃12000r/min，离心10min。6)吸上清，加两倍体积无水乙醇（-20℃预冷）和1/10体积3MNaAc,于-20℃沉淀1h，4℃12000rpm/min，离心10min。5 中国医科大学硕士学位论文7)弃上清，剩下沉淀加800ul75%乙醇（-20℃预冷)。轻弹EP管，4℃,12000rpm/min，5min。8)弃上清，干燥25--30min，待沉淀有些透明未全干时加100ulTE溶解。9)4℃保存，稳定24h后测OD值。2.3.8核心基因甲基化检测采用MSP法检测经TCGA验证的胃癌差异基因甲基化水平。1)亚硫酸盐修饰a)定量DNA，500ng，共20μl到PCR小管中。b)配制CTconversionreagent混合液：900μl水+300μlM-dilutionbuffer+50μlM-Dissolvingbuffer。c)加入130μlCTconversionreagent混合液进入PCR小管中，混匀。d)PCR仪扩增:98℃10min---53℃30min---（53℃6min---37℃30min）*8循环---4℃过夜。e)将600μlM-bindingbuffer加入套管的柱子内。f)将前一天反应结束的样本取出，加入含有M-bindingbuffer的柱子里，混匀。离心10000xg30s，倒掉收集管中废液。g)加入100μlM-washbuffer，离心10000xg30s。h)加入200μlM-Desulphonationbuffer，室温稳定15-20min，离心30s。i)加入200μlM-washbuffer，全速离心30s。重复洗一次。j)加入20μlM-Elutionbuffer，全速离心洗脱30s-1min。k)标号后将样本-20℃冰箱保存。1)引物序列geneForwardprimersequence(5'>3')Reverseprimersequence(5'>3')PCRCCAGACTCCGTCAGTTTCTGCCATCATTCTCCGTCTGTTTGGGTTRTSSTGGGGCGTTTTTTAGTTTGACGTAACAACGATAACTCCGSACCTCGMSP-MGGGGTGTTTTTTAGTTTGATGTACAACAACAATAACTCCAAACCTCAMSP-UAAGGGGGACATTATCCTTGGGCTGGGCTGCTGTTTATCTCRTCASRGGTTCGGGTTTTTAAGTAGCTCAAACGTTACCTATACCGCMSP-MTTAGGTTTGGGTTTTTAAGTAGTTCAAACATTACCTATACCACAAAMSP-UGTCAAGCATCTCAAAATTCTCAACACCACTTTAGCTTCGGGTCAATGCRTCXCL12GGAGTTTGAGAAGGTTAAAGGTCTTAACGAAAAATAAAAATAGACGATMSP-M6 中国医科大学硕士学位论文GAGTTTGAGAAGGTTAAAGGTTGGTAACAAAAAATAAAAATACAACAATMSP-UAR-FCCAGGGACCATGTTTTGCCCGAAGACGACAAGATGGACAART2)RCR反应反应体系：试剂体积(ul)SYBRII10上下游引物0.8模板cDNA1加ddH2O至20μL反应条件：预变性：95℃30s变性：95℃15s退火：56℃30s40cyc延伸：72℃30s终止：4℃2.3.8SST启动子区甲基化BGS测序法检测1)亚硫酸盐修饰同前。2)引物序列：SST-BGS-F:5’-TTTGTTTTTTGTGATTGATTTTG-3’SST-BGS-R:5’-TTTAAAAAAACTAAACATCCCTTAC-3’3)PCR反应a)使用HotStartTaqTakara2.0Version进行PCR反应b)反应体系：试剂体积(μL)10×Buffer(含MgCl225fnmol/l)2.5dNTPMix27 中国医科大学硕士学位论文正反引物1.2HotStartTaqDNA聚合酶0.12模板mDNA1.5加ddH2O至25c)反应条件：预变性：94℃3min变性：94℃20s退火：55℃20s45cyc延伸：72℃1min终延伸：72℃10min终止：4℃扩增产物片段长度为416bp4）测序及结果分析PCR产物测序（反向测序，华大基因公司）后，将测序图结果序列与甲基化引物设计软件得出的甲基化修饰后的模板序列进行比对，依次计算各位点甲基化率。31个位点比对信息如下：位点编号位置位点编号位置位点编号位置M1-182M12-117M23-44M2-167M13-112M24-40M3-165M14-100M25-34M4-162M15-94M26-32M5-148M16-87M27-26M6-146M17-77M28-7M7-133M18-65M29-3M8-130M19-61M305M9-127M20-57M10-121M21-54M11-119M22-49基因组DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，CpG位点未甲基化的胞嘧啶被修饰为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不变。经PCR扩增，尿嘧啶与腺嘌呤配对，之后腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，因此CpG位点甲基化率计算公式如下：8 中国医科大学硕士学位论文正向测序甲化率：Meth%=C/(C+T)*100%；反向序列甲基化率Meth%=G/(G+A)*100%。根据各个位点甲基化率，做以下定义甲基化率>50%为高甲基化平均甲基化率（AMR）定义为全部CpG位点甲基化率平均数超高甲基化位点数（HSC）定义超高甲基化位点个数总和。2.3.9统计学分析统计分析采用SPSS20.0软件。Mann-WhitneyU检验比较不同病变胃黏膜、不同甲基化水平之间SSTmRNA表达差异，P<0.05有统计学意义。3结果3.1胃癌特异性差异甲基化-差异表达基因筛选3.1.1差异甲基化-差异表达基因筛选筛选流程如图3.1所示，我们在GSE29272,GSE13911,GSE25869和GSE30601分别筛选出8327，10339.4516，12260个基因。通过交叉比对，在表达谱芯片中一共得到4817个基因，其中2463个基因低表达，2354个基因高表达。在甲基化芯片进行交叉比对之后，我们得到4113个基因，其中2490个基因为高甲基化基因，1623个基因为低甲基化基因。最后，我们拿重叠的差异甲基化基因和重叠的表达基因进行匹配，最终得到445个高甲基化低表达基因和129个低甲基化高表达基因。9 中国医科大学硕士学位论文3.1差异甲基化-差异表达基因筛选流程图3.1.2差异甲基化-差异表达基因富集分析我们利用DAVID工具对差异甲基化-差异表达基因进行富集分析。通过富集分析发现(表3.1)，高甲基化低表达基因主要和系统过程的调控、信号冲动传递、被动跨膜转运蛋白活性和信号通路有关.低甲基化高表达基因主要和细胞粘附、细胞增殖的调控和蛋白绑定有关。其中高甲基化低表达基因和低价机高表达基因主要位于质膜上。通过KEGG通路分析发现（表3.2），高甲基化低表达基因主要和神经活性配体-受体相互作用和钙离子信号通路在内的八个通路相关。另外，低甲基化高表达基因和癌症相关通路相关。表3.1胃癌相关的差异甲基化-表达基因的基因本体分析10 中国医科大学硕士学位论文CategoryTermgenefunctionCountPValueHyper-LGsGOTERM_BP_FATGO:0044057regulationofsystemprocess371.02E-12GOTERM_BP_FATGO:0007610behavior437.58E-11GOTERM_BP_FATGO:0019935cyclic-nucleotide-mediatedsignaling221.51E-10GOTERM_BP_FATGO:0019226transmissionofnerveimpulse361.64E-10GOTERM_BP_FATGO:0019932second-messenger-mediatedsignaling292.21E-10GOTERM_MF_FATGO:0005261cationchannelactivity314.47E-10GOTERM_MF_FATGO:0022836gatedchannelactivity334.76E-10GOTERM_MF_FATGO:0005216ionchannelactivity376.38E-10GOTERM_MF_FATGO:0015267channelactivity381.04E-09passivetransmembranetransporterGOTERM_MF_FATGO:0022803381.11E-09activityGOTERM_CC_FATGO:0005887integraltoplasmamembrane899.18E-19GOTERM_CC_FATGO:0031226intrinsictoplasmamembrane893.85E-18GOTERM_CC_FATGO:0044459plasmamembranepart1215.46E-15GOTERM_CC_FATGO:0043005neuronprojection388.01E-13GOTERM_CC_FATGO:0005886plasmamembrane1619.07E-11Hypo-HGsGOTERM_BP_FATGO:0030099myeloidcelldifferentiation81.16E-05GOTERM_BP_FATGO:0006955immuneresponse191.37E-05GOTERM_BP_FATGO:0007155celladhesion186.00E-05GOTERM_BP_FATGO:0022610biologicaladhesion186.11E-05GOTERM_BP_FATGO:0042127regulationofcellproliferation197.72E-05GOTERM_MF_FATGO:0042802identicalproteinbinding161.51E-04GOTERM_MF_FATGO:0008134transcriptionfactorbinding110.007478GOTERM_MF_FATGO:0003712transcriptioncofactoractivity90.008199GOTERM_MF_FATGO:0004713proteintyrosinekinaseactivity60.010305GOTERM_MF_FATGO:0030169low-densitylipoproteinbinding30.011865GOTERM_CC_FATGO:0005887integraltoplasmamembrane274.43E-06GOTERM_CC_FATGO:0031226intrinsictoplasmamembrane276.68E-06GOTERM_CC_FATGO:0044459plasmamembranepart373.49E-05GOTERM_CC_FATGO:0005886plasmamembrane503.45E-04GOTERM_CC_FATGO:0005615extracellularspace140.005045缩写：Hyper-LGs：高甲基化低表达基因；Hypo-HGs：低甲基化高表达基因表3.2胃癌相关的差异甲基化-差异表达基因的通路分析TermpathwayCountPValueHyper-LGshsa04080Neuroactiveligand-receptorinteraction322.12E-0911 中国医科大学硕士学位论文hsa04020Calciumsignalingpathway201.96E-05hsa04730Long-termdepression90.003522hsa04742Tastetransduction70.011382hsa04360Axonguidance110.019712Hypo-HGshsa05200Pathwaysincancer100.007863hsa05212Pancreaticcancer40.0422813.1.3差异甲基化-差异表达基因蛋白相互作用网络构建和核心基因选择我们把差异基因提交到STRING数据库后，在高甲基化低表达基因中发现在444个蛋白存在650个相互作用关系，另外在低甲基化高表达基因中发现130个蛋白存在42个相互作用关系。差异基因的蛋白相互作用网络图见图3.2和图3.3.在蛋白相互作用网络中，我们使用centiscape筛选网络中的连接数>10的作为核心蛋白。其中在高甲基化低表达基因组中，前10核心基因为：钙感应受体（CASR）、趋化因子配体12（CXCL12），雌激素受体1（ESR1），G蛋白亚基α1（GNAI1），神经介肽U受体1（NMUR1），生长抑素（SST），雄激素受体（AR），凋亡调节因子Bcl-2（BCL2），鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（s）亚基α同种型短（GNAS）和cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基β（PRKACB）。然而在低甲基化高表达组，没有蛋白之间的连接数大于10。图3.2高甲基化表达基因的蛋白相互作用网络图12 中国医科大学硕士学位论文图3.3低甲基化高表达基因的蛋白相互作用网络图3.1.4模型分析利用MCODE插件，我们对相互作用网络进行分析，得到网络模型。最终在高甲基化低表达组我们得到9组模型，而在低甲基化高表达组得到1组模型。我们进而对高甲基化地表达组进行富集分析（图3.4），其中模型1和模型2主要和G蛋白受体配体活性和神经受体-配体相互作用相关。模型3主要和钾离子跨膜运输和电压门控钾通道活性相关。在低甲基化高表达组中的富集分析中，主要和趋化因子信号传导途径相关（图3.5）。13 中国医科大学硕士学位论文图3.4高甲基化低表达组中前三模型及富集分析图3.5低甲基化高表达基因模型及富集分析3.1.5TCGA数据库和小样本组织验证TCGA数据库是一个包括33个肿瘤的基因表达谱、甲基化、miRNA和拷贝数的综合性的数据库。我们使用TCGA数据库对筛选出来的核心进行进行验证。如表3.3所示，所有的高甲基化低表达基因的甲基化都存在差异，在表达水平，只有6个基因存在差异，其中包括SST，AR，CASR，CXCL12，GNAS和PRKACB。表3.3蛋白相互作用中的核心基因的TCGA验证geneexpressionmethylationCategoryPvalueCategoryPvalueSSTunder-expression2.26E-09hypermethylation6.93E-14ESR1nodifferential>0.05hypermethylation2.58E-14ARunder-expression0.000933hypermethylation2.25E-07CASRunder-expression0.00000144hypermethylation4.55E-15CXCL12under-expression5.94E-17hypermethylation2.91E-14BCL2nodifferential>0.05hypermethylation1.78E-13GNASunder-expression0.0005hypermethylation3.10E-14GNAI1nodifferential>0.05hypermethylation3.59E-07NMUR1nodifferential>0.05hypermethylation1.23E-14PRKACBunder-expression0.000979hypermethylation1.98E-14对上述经TCGA验证的6个基因，利用10对胃癌及癌旁对照组织，采用MSP法和Real-timePCR进一步行小样本组织验证，结果发现：CXCL12、SST、CASR甲基化和表达存在差异。14 中国医科大学硕士学位论文3.2核心基因SST启动子区甲基化及基因表达与胃癌风险相关性分析3.2.1SST启动子区甲基化水平及胃癌特异性差异位点利用BGS测序法检测了30对胃癌及其对照组织中SST启动子区30个CpG位点甲基化水平，结果发现：SST启动子区12，15、16、23、24位点为胃癌差异性高甲基化位点(如表3.4所示).表3.4SSTCpG位点甲基化分析methylationmethylationsitegroupAMR(mean±SD)PsitegroupAMR(mean±SD)PC0.57±0.2191C0.4073±0.2126116N0.6164±0.09670.341268N0.5002±0.10280.036948C0.6128±0.1588C0.566±0.1978217N0.611±0.08520.570485N0.6396±0.07060.431271C0.4474±0.2445C0.6157±0.2169318N0.3756±0.08030.107273N0.6379±0.08640.898061C0.2908±0.1825C0.6139±0.2169419N0.3057±0.12050.509997N0.6498±0.07740.869172C0.5288±0.2072C0.6562±0.2101520N0.5744±0.12740.595595N0.727±0.05230.161492C0.4808±0.1871C0.6229±0.1768621N0.5601±0.12070.264263N0.6964±0.04920.350634C0.5124±0.3088C0.6492±0.1888722N0.4349±0.11530.527776N0.6812±0.08930.811947C0.5176±0.1956C0.5185±0.2104823N0.5003±0.17640.46414N0.4765±0.0890.046038C0.5281±0.2252C0.5549±0.1756924N0.5408±0.17730.509997N0.5271±0.09390.033759C0.4936±0.2396C0.5487±0.20981025N0.4864±0.13790.509997N0.5618±0.08390.941641C0.4998±0.2649C0.57±0.22831126N0.4932±0.12120.687223N0.4765±0.14810.095831C0.3174±0.221C0.5073±0.26191227N0.4817±0.14720.004558N0.4788±0.11990.546541C0.521±0.2316C0.3867±0.26281328N0.5851±0.10760.190682N0.3984±0.14510.89717C0.5091±0.2567C0.4441±0.25431429N0.5507±0.14140.452996N0.4803±0.090.481061C0.4586±0.2225C0.4647±0.26281530N0.5407±0.09290.018685N0.4955±0.14590.8403283.2.2特异性甲基化位点与胃癌发病风险之间的关系15 中国医科大学硕士学位论文计算cpg12,cpg15,cpg16,cpg23,cpg24之间的平均甲基化率。观察特异性甲基化位点之间平均甲基化率和风险的关系。表3.5：特异性甲基化位点与胃癌发病风险的的关系AMRPnormal0.45134±0.208420.041618cancer0.50524±0.105163.2.2SST甲基化与临床病理参数之间的关系分析30对胃癌组织中SST平均甲基化率（AMR）和胃癌的临床病理参数的关系。发现胃癌各临床病理参数组间SSTAMR差异均无统计学意义。（表3.5）表3.6SST平均甲基化率（AMR）与胃癌临床病理参数相关性AMRPhighlown2010male1480.884genderfemale62<60750.693age>60135NO650.503Lymph.node.metastasisYES145Intestinal-310.771typeLauren.s.classificationDiffuse-179typenegative640.891HPpositive146I-II531TNMIII-IV157negative230.386invasiondepthpositive1873.2.3SST一致性甲基化位点与临床病理参数之间的关系通过测序结果发现，SST的CPG12、CPG15、CPG16、CPG23和CPG24差异性位点，故以此为特异性甲基化位点的平均甲基化率进行分析。结果未发现上述甲基化位点在胃癌各临床病理参数组间存在显著差异。（表3.6）16 中国医科大学硕士学位论文表3.7SST高甲基化位点平均甲基化率与胃癌临床病理参数相关性AMRPhighlown1911male1570.627genderfemale44<60750.938age>60126NO650.714Lymph.node.metastasisYES136Intestinal-310.73typeLauren.s.classificationDiffuse-1610typenegative641HPpositive137I-II531TNMIII-IV148negative230.498invasiondepthpositive1783.2.5SST基因mRNA水平表达比较69对胃癌及其对照组织中SSTmRNA表达水平是否存在差异。结果显示SST的正常中高表达，结果存在统计学差异。（表3.7）表3.8，SSTmRNA水平表达groupNmRNA(mean±SD)PNOR7010.391±4.028GC696.282±2.1678.45E-12图3.6，SSTmRNA水平表达17 中国医科大学硕士学位论文3.2.6SST表达和临床病理参数的关系进一步，我们将SST表达水平按照中位值分成高低标志两组，分析SST的表达和胃癌临床病理参数之间是否存在差异。统计分析发现，SST的表达与临床病理参数无显著相关性表3.9，SSTmRNA水平表达SSTPmale0.005±0.0090.137genderfemale0.015±0.027<600.012±0.0180.267age>600.006±0.018NO0.006±0.009262Lymph.node.metastasisYES0.011±0.02Intestinal-0.002±0.0020.011typeLauren.s.classificationDiffuse-0.011±0.020typenegative0.009±0.0210.874HPpositive0.008±0.016I-II0.002±0.0020.017TNMIII-IV0.01±0.019negative0.002±0.0030.5invasiondepth0.0097±0.018positive73.2.6五个显著性甲基化位点平均甲基化与表达之间的关系我们计算五个显著性甲基化位点的平均甲基化率，与表达进行匹配后比较是否存在相互作用关系。如图所示，表达和甲基化之间存在弱负相关趋势。18 中国医科大学硕士学位论文19 中国医科大学硕士学位论文讨论癌症是遗传，表观遗传，体细胞和内分泌突变的产物[10]。DNA可以改变基因的表达[11]，进而促进肿瘤的发生发展。低甲基化一般发生在早期，并且和染色体不稳定和印记丢失有关。然而高甲基化则主要发生的基因的启动子区，和基因的沉默有关[12]。芯片和高通量测序的发展使我们可以检测所有人体基因的表达水平和甲基化水平。因此我们可以通过高通路测序技术来分析那些收甲基化调控的基因的表达水平。在我们的研究中，我们定义了447个差异性高甲基化低表达基因和130个差异性低甲基化高表达基因。这些基因可能在胃癌的发生发展中起到了重要的作用。高甲基化低表达基因的GO分析提示，这些基因主要和阳离子通道活性、门控通道活性和离子通道活性有关。说明高甲基化低表达基因主要影响通道活性。这个结果和我们目前已知的离子通道和在肿瘤细胞中和在正常细胞中是不一样的结论是一致的[13]。同样的我们发现低甲基化高表达基因和细胞增殖调控、免疫应答和细胞粘附有关。说明细胞增殖和粘附的无效或功能的缺失确实是肿瘤发展的重要原因[14]。高甲基化低表达基因的通路分析显示其主要是通过影响钙信号通路来影响胃癌的发生和发展的。钙离子对于细胞信号传导是重要的，因为一旦它们进入细胞的胞质溶胶，它们对许多酶和蛋白质发挥变构调节作用[15,16]。癌症和正常细胞的差异变化都涉及到钙信号通路的变化，其可以通过影响细胞增殖、凋亡和转移来影响胃癌的发生。综上，可以看出高甲基化在肿瘤的发生发展中起到了重要的作用。另外在低甲基化高表达基因中的通路分析显示其主要和肿瘤相关通路有关。说明低甲基化也影响肿瘤的发生发展。我们在高甲基化低表达的蛋白相互作用网络中检测到9个模型。其中前2的模型都和神经受体配体相互作用有关，说明甲基化可能主要通过影响这个通路基因的表达进而影响肿瘤的发生发展。现在甲基化的研究主要集中在对于细胞生物功能的影响上，因此在神经受体配体相互作用上的收到甲基化影响的基因应该进一步得到重视。低甲基化高表达基因中只发现一个模型。这个模型主要和趋化因子信号通路有关。但是在高甲基化基因中CXCL12也参与趋化因子信号通路。说明在这个通路中，高甲基化和低甲基化有参与其调节作用。20 中国医科大学硕士学位论文另外TCGA数据库是世界上最大的综合性基因数据库。它包括提供了包括胃癌的33个肿瘤的全面的多维的关键基因组图谱。我们通过TCGA数据库来验证核心基因的准确性。最终在10个核心基因中6个核心基因和我们的分析结果是相同的。这个结果说明SST，AR，CASR，CXCL12，GNAS和PRKACB是高甲基化低表达基因组中的核心基因。生长抑素（SST）是由胃肠道、胰腺和一部分中枢神经系统分泌。SST的主要功能是调节内分泌和外分泌激素的分泌、调节肠道活动，并控制胃肠道中胃泌素刺激的胃酸的分泌[17]。JacksonK等检测了32对胃癌及其癌旁正常中SSTmRNA表达和甲基化状况，发现相较于正常组织，胃癌组织中SST呈低表达、高甲基化状态[18]。GNAS编码参与腺苷酸环化酶活化的G蛋白α亚基（Gαs），从而增加信号分子cAMP的水平[19]。Liu等人研究了GNAS的甲基化区域的差异变化发现GNAS的甲基化改变可以降低目标组织中的Gαs的表达[20]。已经有多篇文章报道胃癌的发展是激素依赖性的，雌激素功能的失调和胃癌是相关的。ESR1是一种核激素受体，参与真核基因表达的调控，从而影响靶组织中的增殖和分化。Binnur等发现在胃癌中ESR1存在高甲基化。在核心基因中另外一个激素相关的基因是AR。David等发现AR的甲基化在前列腺癌影响其表达[21]。CXCL12是一个趋化因子相关的基因。Yu等发现在胃癌中CXCL12的高甲基化影响其本身基因的表达，提示其甲基化可能在胃癌转移中起作用[22]。CASR是一个G蛋白偶联受体，其在感受细胞外钙离子浓度的变化并在维持钙稳态中起关键作用。KeiichiHizaki等研究发现在结直肠癌中CASR的甲基化水平和表达水平存在负相关的关系[23]。目前对于PRKACB的甲基化和表达水平的相关性还有没有人研究。在上述核心基因中，SST、CXCL12和CASR都和GPCRs相关。其中GPCRs已经成为肿瘤生长和转移的重要参与者。因此，可以看出，“生物信息学筛选，基因本体论和功能分析和TCGA验证”可能是一种新颖且可行的方法，基于甲基化的生物标志物可能作为用于精确诊断和治疗癌症的可能具有预测性。生长抑素(Somatostatin,SST)是一种环状的14肽激素，对人体多种激素分泌具有重要调节作用。SST广泛存在于胃肠道粘膜“D”细胞，以胃窦和胃体分布最多。SST通过旁分泌机制由突起释放到G细胞和壁细胞膜上，抑制胃泌素和HCI分泌。SST对于胃酸分泌具有很强的抑制作用,RArnold等报道D细胞可分泌SST，并通过生长抑素受体2(SSTR2)来抑制胃酸分泌[24].胃溃疡患者由于SST分泌受抑，导致胃酸分泌增加，进一步加重溃疡病变[25]。Chuang-yingHu研究发现，SST高表达可抑制胃癌细胞增殖[26],SST通过上调抑癌基因p27kip1表达诱导细胞21 中国医科大学硕士学位论文周期阻阻滞[27]，还可通过抑制细胞因子或激素如表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)及其受体(EGFR)、胃泌素、胰岛素等合成与分泌间接发挥其抗肿瘤作用[28,29]。此外，关于SST的表观遗传学调控，MisawaKiyoshi等发现，头颈部肿瘤中SST及其受体SSTR1基因表达受甲基化调控[30]。WVerlaat等利用广度的基因甲基化芯片研究发现，子宫颈癌中SST表达受到甲基化调控[31]。在胃癌中，JacksonK等[18]检测了32对胃癌及其癌旁正常中SSTmRNA表达和甲基化状况，发现相较于正常组织，胃癌组织中SST呈低表达、高甲基化状态。综上，通过基因表达和甲基化谱芯片数据的综合分析，揭示了胃癌中差异性甲基化差异性表达的新综合信息。这些信息可能有助于促进对涉及胃癌发展和进展的表观遗传调控机制的理解。另外，确定了与差异性基因相关蛋白相互作用网络中的一组核心基因。这些基因具有潜在的预测和预后价值。同时可能可以用于胃癌精准诊断和治疗。但是需要分子生物学实验以确认这些核心基因在胃癌中的相关的功能。22 中国医科大学硕士学位论文本研究创新性的自我评价1.首次利用生物信息学方法结合组织学验证，筛选得到了一组胃癌风险相关的差异甲基化-差异表达基因。2.首次联合探讨胃癌相关MDEGs候选基因SST甲基化、基因表达与胃癌发生发展的相关性。23 中国医科大学硕士学位论文参考文献[1]CHENW,ZHENGR,BAADEPD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:acancerjournalforclinicians,2016,66(2):115-32.[2]BIRDA.Perceptionsofepigenetics[J].Nature,2007,447(7143):396-8.[3]ZOURIDISH,DENGN,IVANOVAT,etal.Methylationsubtypesandlarge-scaleepigeneticalterationsingastriccancer[J].Sciencetranslationalmedicine,2012,4(156):156ra40.[4]SAEYSY,INZAI,LARRANAGAP.Areviewoffeatureselectiontechniquesinbioinformatics[J].Bioinformatics,2007,23(19):2507-17.[5]IRIZARRYRA,BOLSTADBM,COLLINF,etal.SummariesofAffymetrixGeneChipprobeleveldata[J].Nucleicacidsresearch,2003,31(4):e15.[6]WILSONLE,HARLIDS,XUZ,etal.Anepigenome-widestudyofbodymassindexandDNAmethylationinbloodusingparticipantsfromtheSisterStudycohort[J].Internationaljournalofobesity,2017,41(1):194-9.[7]COPELM,IRIZARRYRA,JAFFEEHA,etal.AbenchmarkforAffymetrixGeneChipexpressionmeasures[J].Bioinformatics,2004,20(3):323-31.[8]RHODESDR,KALYANA-SUNDARAMS,MAHAVISNOV,etal.Oncomine3.0:genes,pathways,andnetworksinacollectionof18,000cancergeneexpressionprofiles[J].Neoplasia,2007,9(2):166-80.[9]HUANGWY,HSUSD,HUANGHY,etal.MethHC:adatabaseofDNAmethylationandgeneexpressioninhumancancer[J].Nucleicacidsresearch,2015,43(Databaseissue):D856-61.[10]XUZ,WANGZ,JIAX,etal.MMGZ01,ananti-DLL4monoclonalantibody,promotesnonfunctionalvesselsandinhibitsbreasttumorgrowth[J].Cancerletters,2016,372(1):118-27.[11]GYORFFYB,BOTTAIG,FLEISCHERT,etal.AberrantDNAmethylationimpactsgeneexpressionandprognosisinbreastcancersubtypes[J].Internationaljournalofcancer,2016,138(1):87-97.[12]LEEJJ,GELIJ,LARSSONC,etal.Gene-specificpromoterhypermethylationwithoutglobalhypomethylationinfollicularthyroidcancer[J].Internationaljournalofoncology,2008,33(4):861-9.[13]DJAMGOZMB,COOMBESRC,SCHWABA.Iontransportandcancer:frominitiationtometastasis[J].PhilosophicaltransactionsoftheRoyalSocietyofLondonSeriesB,Biological24 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中国医科大学硕士学位论文综述甲基化介导的基因沉默作为胃癌生物标志物的研究进展虽然胃癌（gastriccancer，GC）的发病率呈逐年下降趋势，但其仍然是全球第四大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因[1]。近些年在早期诊断，手术技术和围手术期管理方面的进展提高了患者的生存率;然而，GC由于其高发病率，不良预后和有限的治疗选择原因仍然具有挑战性。GC的病死率高于如结直肠癌，乳腺癌和前列腺癌在内的其他常见恶性肿瘤[2]。由于GC患者的预后依赖于诊断时的肿瘤分期和选择合适的治疗策略，因此迫切需要用于早期诊断和预后预测的新型生物标志物。越来越多的证据表明，癌症是由表观遗传和遗传异常引起的[3]。DNA甲基化是一种表观遗传修饰之一，其可以调节基因表达，是癌发生的早期标志性事件[4]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶家族的酶催化的共价化学修饰，其介导将甲基（CH3）基团添加至胞嘧啶的第5个碳。DNA甲基化通常发生在被称为CpG岛（CGIs）的5'-CG-3'（CpG二核苷酸）成簇区域内，这些区域通常被发现在其基因的启动子附近[5]。基因启动子CGIs内甲基化的发生与致密染色质结构相关，并与遗传基因特别是肿瘤抑制基因的转录沉默有关[6]。许多研究报道，许多肿瘤抑制基因在癌症预防（DNA修复，细胞粘附，细胞周期控制和凋亡）功能中发挥关键作用，它们在致癌过程中被其启动子的甲基化沉默[7]。因此，我们推测某些基因的DNA甲基化状态可以成为预测肿瘤发生和预后的生物标志物。此外，DNA甲基化生物标志物比遗传和血清标志物提供了几个优点[8,9]。首先，特异性CGI异常DNA甲基化的发生率高于遗传异常[10]。其次，使用简单的技术即甲基化特异性PCR可以敏感地检测癌症中观察到的异常DNA甲基化。第三，异常的DNA甲基化似乎在早期肿瘤的发生中，可以导致关键过程的丧失和/或获得本文综述了GC中DNA甲基化生物标志物的现状和最新证据，并评估这些生物标志物用于GC患者风险评估，早期诊断和治疗及预后评估的临床潜力一、胃癌风险相关DNA甲基化异常基因启动子的甲基化现在被认为是用于沉默肿瘤相关基因（特别是肿瘤抑制基因）以及遗传改变的主要机制之一。自从Fang等[11]在1996年描述GC中c-myc和c-Ha-ras的DNA低甲基化的第一篇文章以来，已经发表了许多关于DNA甲基化参与GC的研究。迄今为止，GC[12-16]报道了超过100种基因的异常DNA甲基化，如27 中国医科大学硕士学位论文肿瘤抑制基因（包括E-cadherin，RASSF1A，p16，GSTP1，SOCS1，SFRP1和PTEN）。其中的一篇meta分析[17]回顾了143个病例对照研究，报告了142个单个基因的甲基化频率。因此，与癌旁正常组织中相比，在癌症组织中总共发现70个基因发生显著高甲基化。E-cadherin是GC中最重要的肿瘤抑制基因之一，其表达失活可以通过增殖，侵袭和转移增加而促进肿瘤进展。在早期阶段，E-cadherin在各种癌症（包括GC和特别是未分化的GC）中被甲基化沉默[12]。然而，在肿瘤和相应的非肿瘤性胃粘膜中也经常观察到E-cadherin甲基化。年龄相关的E-cadherin甲基化通常存在于大约45岁起的胃粘膜[18]。RASSF1A是Ras相关结构域家族的成员，它是一种肿瘤抑制基因，它通过调节Ras信号通路在细胞周期调控，细胞凋亡和微管稳定性中发挥关键作用[19]。RASSF1A突变并不常见，而癌基因启动子甲基化沉默常常发生，包括GC[20,21]。相反，这种甲基化只发生在一小部分非肿瘤性胃上皮细胞中[22]。此外，RASSF1A甲基化与GC患者的TNM分期和预后不良密切相关[23]。因此，RASSF1A甲基化代表了GC中潜在的诊断和治疗目标。二、胃癌环境致病因素相关DNA甲基化异常1、幽门螺杆菌感染相关DNA异常甲基化众所周知，幽门螺杆菌影响胃癌的发生和发展[24]。幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性螺旋形细菌，存在于全世界大约一半人口的胃中[25,26]。许多前瞻性研究表明幽门螺杆菌感染在胃癌发生中起重要作用[27]，幽门螺杆菌诱导的DNA甲基化引起的胃癌发生机制已得到阐明。Maekita等[27]通过内镜检查从154例健康志愿者和72例分化型胃癌患者的胃粘膜组织中提取了8个病灶中7个CGIs的甲基化水平。数据表明，幽门螺杆菌感染可以诱导不同程度的多种CGIs的甲基化，并且正常胃粘膜中特定CGI的甲基化水平与幽门螺旋杆菌阳性个体中GC的风险相关。之前研究也表明幽门螺杆菌感染通过启动子甲基化在GC中导致RUNX3表达缺失[28]。在RUNX3缺陷小鼠中，一些胃上皮细胞分化成肠型细胞，表明RUNX3表达的缺失触发了癌前期肠上皮化生（IM）[29]。此外，无论幽门螺杆菌感染的状态如何，IM中甲基化基因的数量显着高于无IM的慢性胃炎中发现的基因数[30]。然而，最近的研究已经深入研究了miRNA甲基化在GC中的作用。Ando等[31]研究发现幽门螺杆菌感染的胃粘膜显示三种miRNA（miR-124a-1，miR-124a-2和miR-124a-3）的甲基化水平显着高于未感染幽门螺杆菌健康志愿者。因此，miRNA基因的甲基化诱导的沉默以及蛋白质编码基因可能导致GC形成。关于胃黏膜甲基化水平与胃癌发生风28 中国医科大学硕士学位论文险的相关性，Nakajima等[32]研究发现单胃癌患者胃黏膜甲基化水平明显升高，而HP阳性患者的甲基化升高水平明显高于HP阴性患者。此外，先前已经表明由幽门螺杆菌感染触发的炎症的发展对于异常甲基化是关键的，并且包括IL-1β，Nos2和TNF在内的炎症相关基因在胃中的表达影响其他基因DNA甲基化[33,34]。IL-1β直接诱导E-cadherin的启动子甲基化，E-cadherin是参与维持上皮稳定性的重要细胞外基质成分[35]。即，幽门螺杆菌诱导的E-cadherin启动子的甲基化是通过IL-1β介导的。此外，IL-1β是幽门螺杆菌诱导的TGF-β1甲基化的重要介质[36]。如前所述，基础和临床研究已经证明幽门螺旋杆菌感染与GC中的异常甲基化密切相关。同时，消除幽门螺旋杆菌显着降低基因甲基化已经越来越清楚[37,38]。在癌前病变中去除幽门螺杆菌诱导的异常DNA甲基化将是预防癌症的新方法。Niwa等[39]表明，5-aza-dC治疗使用蒙古沙鼠模型防止了幽门螺旋杆菌诱导的GC的发展。因此，幽门螺杆菌诱导的异常DNA甲基化的去除和/或抑制可以预防幽门螺杆菌相关的癌症。2、EBV病毒感染相关DNA异常甲基化EB病毒（EBV）在初次感染时引起传染性单核细胞增多症，超过90％的成人患者成为EBV携带者[40]。众所周知，EBV与几种恶性肿瘤有关，如伯基特淋巴瘤和鼻咽癌[41]。EB相关GC（EBVaGC）于1990年首次发现[42]。EBV感染发生在癌发生的早期阶段，并在癌症发展中起重要作用。此外，先前的研究报道EBVaGC中异常启动子甲基化相较于EB病毒非相关胃癌（EBVnGC）发生更频繁[43,44]。在EBVaGC患者中特异性观察到APC，p16，MINT1，TP73和HOXA10基因启动子区域的DNA甲基化[45]。此外，EBVaGC中7种基因（TP73，BLU，FSD1，BCL7A，MARK1，SCRN1和NKX3.1）的甲基化频率显着高于EBVnGC患者[46]。关于在胃上皮细胞EBV感染早期期间宿主DNA甲基化的分子机制，人类DNA甲基转移酶（DNMT）作为甲基化驱动因子在EBV感染期间受到关注。据报道，LMP2A诱导STAT3的磷酸化，其激活DNMT1转录并在EBVaGC中导致PTEN启动子的甲基化进而影响PTEN表达[47]。Zhao等[48]也表明EBV启动子甲基化的诱导受LMP2A上调DNMT3b的调控。此外，Matsusaka等[49]最近进行的大规模分析使用InfiniumHumanMethylation27BeadChip（Infinium，Illumina，SanDiego，CA，UnitedStates）评估了GC的DNA甲基化谱。作者根据DNA甲基化模式将GC分为三种表观型（EBV-/低甲基化，EBV-/高甲基化和EBV+/高甲基化）。EBV阳性GC表现出明显和显着高水平的甲基化，而CXXC4，TIMP2和PLXND1基因在EBV阳性表型中特异甲基化。MLH1在EBV-/高甲基化表位型中优先甲基化;然而，在EBV+29 中国医科大学硕士学位论文/高甲基化表位型中没有检测到甲基化。也就是说，作者鉴定出与EBV感染相关的特定基因型，并证明在EBV阳性GC中观察到的表观遗传改变直接由EBV感染引起。三、DNA甲基化标志检测在胃癌诊疗中的应用1、早期诊断25％的晚期GC病例，全球5年生存率约为20％-25％。然而，如果早期发现疾病，存活率可提高到60％以上，因此GC的早期诊断早期诊断至关重要。体液，特别是血液含有来自其他组织和器官的各种分子。这些分子可以表明癌症的存在，因此是潜在的癌症生物标志物。第一代肿瘤标志物，如CEA，CA19-9和CA72-4，与GC的发展有关;然而，这些标记物都不可用于GC的筛选和早期检测。使用PCR技术很容易扩增的核酸代表了生物标志物开发的明显潜在目标。大约四十年前首次报道了凋亡或坏死肿瘤细胞释放的循环肿瘤DNA[50]。循环肿瘤DNA不仅携带肿瘤特异性遗传信息，而且携带表观遗传标记，特别是DNA甲基化。在GC患者中使用DNA甲基化试验将有助于开发用于GC的早期检测和诊断的新型生物标志物。Abbaszadegan等[51]评估了胃癌组织中GC最常见的甲基化基因之一p16的甲基化以及从GC患者获得的相应血清。在44.2％的GC组织中检测到p16启动子的异常甲基化（23/52），而所有正常胃粘膜样品（n=50）均未甲基化。此外，在p16甲基化患者中，60.9％（14/23）在其相应的血清样品中也显示出甲基化。因此，血清中DNA甲基化的检测是GC早期检测的潜在生物标志物。Kanyama等[52]也证明，无论肿瘤分期和/或临床病理特征如何，在GC患者获得的23份血清样本中有6份（26.1％）观察到p16异常DNA甲基化，因此表明p16甲基化也是一种潜在的早期检测GC的生物标志物。另外，据报道，血清中的其他甲基化标记如RUNX3，MGMT，DAPK，TFPI，RASSF1A和SOCS1可用于早期检测GC[53,54]。Leung等[55]研究了GC患者血清DNA的多基因甲基化，重点研究了10个肿瘤相关基因（APC，E-cadherin，GSTP1，hMLH1，MGMT，p15，p16，SOCS1，TIMP3和TGF-βRII）。在这10个基因中，与健康志愿者相比，GC患者中APC（17％），E-钙粘蛋白（13％），hMLH1（41％）和TIMP3（17％）显着甲基化。此外，在这四种基因中的至少一种基因中，在60名（55％）患者中的33名的血清中检测到甲基化。这些结果表明血清中DNA甲基化的检测对GC患者具有诊断价值。30 中国医科大学硕士学位论文另外的一个GC早期检测尝试，其研究了胃洗液中的甲基化标记物。因为在胃液中可以发现许多粘膜细胞，所以在胃液中检测分子标记物是筛选GC的可能的非侵入性方法。Oishi等[56]将Sox17甲基化鉴定为使用胃洗样品的全基因组DNA甲基化分析检测GC的候选生物标志物。此外，Watanabe等[90]认为MINT25是一种筛选GC的敏感和特异性标记。作者最初评估了24个组织样本，并确定了6个甲基化基因（MINT25，RORA，GDNF，ADAM23，PRDM5和MLF1）。这6个基因的甲基化水平根据从正常胃粘膜到前期病变再到GC随着疾病的进展甲基化显着增加。这六种基因的功效随后也在153个不同人群的胃液中得到了验证。因此，就胃液中的肿瘤检测而言，MINT25甲基化显示出最佳灵敏度（90％）和特异性（96％）。2、预后评估预测GC患者预后的最常用工具是TNM分期。然而，一些GC表现出了与TNM分析所预测的结果不同的结果;因此，进一步信息的积累和诸如分子生物标志物等指标的识别对于精确预测预后是必要的。大量的研究发现异常DNA甲基化与GC患者预后之间的关联[57,58]。目前研究表明大量基因（包括p16，E-cadherin，MGMT，RASSF1，RUNX3等）被CGIs高甲基化抑制[59]。在这些基因中，E-cadherin和MGMT[60]的启动子甲基化GC患者术后恶化的结果相关。此外，Wanajo等[58]将CACNA2D3（钙通道电压依赖性α2/δ亚基3）的甲基化鉴定为晚期胃癌患者预后不良的有力指标。此外，Kim等[61]认为galectin-7的表达受DNA甲基化的严格调控，可能作为GC的预后指标。另外还有研究表明三叶因子1（TFF1）的表达被DNA甲基化沉默，并与GC患者的肿瘤侵袭和不良生存相关[62]。TFF1被认为是GC中的肿瘤抑制基因。作者评估了182位GC患者中TFF1的免疫组织化学表达，并检查了TFF1的水平是否与临床病理因素和/或患者存活相关。因此，发现TFF1的低表达与单独手术治疗的108例GC患者的生存率差异独立相关。此外，硫酸氢钠测序证明TFF1表达在GC细胞和组织中均受DNA甲基化调控。虽然以前大多数研究是在GC组织中评估DNA甲基化，但从血液样本中获得的表观遗传信息也可能是GC患者的重要预后生物标志物。据报道，血液白细胞DNA中高甲基化胰岛素样生长因子2（IGF2）患者的生存率明显高于低甲基化IGF2患者。如上所述，许多以前关于GC甲基化的研究都集中在单个甲基化基因的预后意义上。然而，LINE-1的甲基化水平被认为是整个基31 中国医科大学硕士学位论文因组DNA甲基化检测的替代指标[63,64]。Shigaki等[65]首次报道根据LINE-1低甲基化状态与GC患者生存率差相关。关于CIMP状态的预后价值，据报道，CIMP高与总体生存率更高有关，但该参数不是切除GC的患者的独立预后因素。在另一项研究中，日本78个主要GC中CIMP阴性患者的生存率显着低于CIMP高或CIMP低患者[66]。相反，两位研究人员报道14个CGIs位点或以上的甲基化与临床结果不良有密切关系，并被发现是南韩196例胃癌的独立预后因素[67,68]。此外，另一份报告显示CIMP阳性组和CIMP阴性组的生存率无显着差异[69]。因此CIMP状态预后值在GC的设定中有争议。需要进行大规模的研究来验证CIMP状态与GC患者预后之间的关系。尽管胞嘧啶（5-mC）第5位的DNA甲基化是与GC预后相关的关键表观遗传标记，5-mC通过DNA十羟基转移酶的十至十一易位家族转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。近年来，5-hmC对癌症特征的影响已被广泛认可。然而，5-hmC对包括GC在内的人类癌症预后的重要性仍然大部分未知。Yang等[70]指出5-hmC水平降低是GC患者预后不良的独立因素。microRNA的直接或间接甲基化也可能影响GC的预后[71]。近来已经开发了用于分析GC的分子基础的快速且可靠的方法，并且表观遗传修饰对预后的影响。结论在过去的十年中，检测技术的进步大大加速了癌症表观遗传领域研究的进展。异常DNA甲基化导致细胞增殖、分化及凋亡过程失调，促进癌症进展。DNA甲基化很有可能为了解胃癌恶性行为提供有价值的信息。进一步研究调控胃癌发生、侵袭转移和耐药性的DNA甲基化状态将有助于为胃癌早期发现策略和治疗决策的制定提供有价值线索。参考文献[1]FERLAYJ,SHINHR,BRAYF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOCAN2008[J].Internationaljournalofcancer,2010,127(12):2893-917.[2]NAGINIS.Carcinomaofthestomach:Areviewofepidemiology,pathogenesis,moleculargeneticsandchemoprevention[J].Worldjournalofgastrointestinaloncology,2012,4(7):156-69.[3]BAYLINSB,JONESPA.Adecadeofexploringthecancerepigenome-biologicalandtranslationalimplications[J].NaturereviewsCancer,2011,11(10):726-34.32 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中国医科大学硕士学位论文致谢转眼间，在肿三两年半的研究生学习生活就要结束了，而入科时的懵懂状态犹历历在目。回忆起这两年半的点点滴滴，令我感慨不已，欣慰之余又非常庆幸。欣慰的是，这两年多的时间里我踏实度过，学到了许多受益无穷的东西;庆幸的是，我来到了一个非常好的学习环境，遇到了很多的良师益友，给我了很多的指引和帮助，使我能够顺利地完成学业，再此谨向他们表示最衷心的感谢！首先感谢我亲爱的导师孙丽萍老师。孙老师在科研中谆谆教诲，在学术上给了我明确方向，生活中无微不至关怀。无论我多么愚钝，您总是耐心教导，给我无尽的鼓励与信心；在我实验失败的时候，孙老师您给我打气;在我咬牙坚持的时候，您给我加油。总之，孙老师无论在什么时候都给了我最大的信任，用她的言传身教，使我学到了许多书本上没有的东西，这也是我获得的最宝贵的财富。另外还要感谢敬爱的袁媛教授在科研、生活上给予的指导和帮助以及对论文提出宝贵的修改意见。您治学严谨的科学态度，兢兢业业的工作作风，积极乐观的生活态度，深深感染了我。还要感谢徐倩、景晶晶、宫月华、董楠楠、王泽洋、李逸老师在实验工作中的指导和帮助；同时感谢他们在生活上给予的关心和帮助。感谢刘爽师姐、周荃师妹、戴显通师弟以及沈诗璇、刘经纬对我课题完成过程中给予的的帮助和宝贵意见，感谢张清月、王丹、冯雪、陈晓慧在生活和学习中给予我的帮助和建议，感谢你们创造的欢乐和谐生活学习环境，让我三年学习生活充满快乐和收获多多。衷心祝愿所有帮助我的老师、同学身体健康，工作顺利，心想事成。李浩2018.05.2540 中国医科大学硕士学位论文个人简历姓名：李浩性别：男民族：汉学习经历：2009年9月–2014年7月重庆医科大学临床医学专业本科2015年9月–至今中国医科大学第一临床学院肿瘤学专业硕士研究生41