生物单分子力谱技术及应用研究

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1、ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第－所现代大学ＦＯＵＮＤＥＤｎ１８９５博士学位论文Ｂｉｌｌ｜｜ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ＾Ｍ—级学科仪器科学与技术：学科专业：仪器科学与技术作者姓名：雷海指导教师：胡小唐教授天津大学研究生院２０１７年５月生物单分子力谱技术及应用研究StudyOntheTechnologyandApplicationsofSingleMoleculeForceSpectroscopy一级学科：仪器科学与技术学科专业：仪器科学与技术研究生：雷海

2、指导教师：胡小唐教授天津大学精密仪器与光电子工程学院二零一七年五月摘要生物单分子力谱技术不仅从单分子层面揭示了生命活动的本质，还是疾病早期诊断、纳米药物研制、仿生工程等领域的重要研究手段。目前，原子力显微镜(AFM)、光镊、磁镊是单分子力谱测量中应用最为广泛的技术，但不同仪器和方法测量结果存在较大差异，使得对比测量困难，影响单分子力谱学的持续性发展，已成为该领域亟待解决的关键问题。本文聚焦生物单分子力谱技术中力与位移的准确测量，采用单分子AFM和光镊技术进行了实验研究，从“探针”弹性常数和分子体系设计两方面探讨

3、了单分子力谱测量技术的准确性和适用性，并开展了应用研究；同时，设计并研制了一套高通量单分子力谱并行测试系统，能够对多个单分子进行并行测量，为单分子力谱实验中一次测量单个生物分子所引起的差异性提供了新的解决方法。课题的主要内容和创新点如下：1、从生物分子体系设计、测量技术与仪器和实验技术与方法三方面系统分析了单分子力谱技术的差异与存在的问题。对生物单分子特别是蛋白质解折叠和折叠动力学研究中动力学参数计算及影响因素进行理论分析。2、利用AFM不同探针对蛋白(NuG2)8的解折叠过程进行研究，从实验角度剖析了探针弹性

4、系数对单分子力谱测量的影响；同时，结合蛋白工程技术，首次直接观察到金属蛋白Ferredoxin的可逆解折叠/折叠过程以及铁硫键的断裂，这为金属蛋白的折叠机制和铁硫键的研究提供了新的方法。3、采用光镊技术对蛋白NuG2及其四聚体的解折叠和折叠动力学过程进行研究分析，首次从实验上验证在单分子力谱测量中蛋白质单体及其多聚体是等价的；结合蛋白质工程技术，设计了GA/GB及其系列突变蛋白的分子体系，对其解折叠/折叠动力学过程进行研究与分析，首次从力学角度证明氨基酸序列决定蛋白折叠、结构和功能。4、提出并研发了一套基于旋转

5、离心力和数字全息显微技术的高通量单分子力谱并行测量系统，同时提出基于数字全息显微和矢径投影图像匹配算法实现了液态环境微球三维位置的纳米精度快速测量，并开发了基于CUDA的GPU加速图像处理技术。通过抗体-抗原相互作用和DNA拉伸实验对系统的可行性和适用性进行了验证，有效解决了AFM、光镊等技术一次只能测量单个分子，效率低下，且不能避免由于样品差异性以及实验条件变化导致的测量不准确性等问题。关键词：单分子力谱，AFM，光镊，磁镊，蛋白质解折叠，位置测量，高通量IABSTRACTSinglemoleculeforc

6、espectroscopy(SMFS)hasemergedasapowerfultooltoinvestigatetheintrinsicoflifeinasinglemoleculelevel,andalsoplayedanimportantroleintheareaofdiseasediagnosis,drugdiscovery,biomaterialsandbiomimeticengineering.Themostcommonforcespectroscopytechniquesareatomicforc

7、emicroscopy(AFM),opticaltweezersandmagnetictweezers.However,withdifferenttechniquesandmethods,theresultswouldbedifferent,whichmakesithardtocomparethesemeasurements.ThishasbeenthekeyissuesinSMFS,whichdefinitelyhinderedthedevelopmentofsinglemoleculeforcespectr

8、oscopy.Thisdissertationfocusonthemeasurementofforeceandpositon,withtechniquesofAFMandopticaltweezers,discussedtheeffectofthetipsspringconstantandthesampledesignonthefeasibilityandveracityofsingl