A型肉毒毒素鼻腔给药对氯化锂—匹鲁卡品大鼠癫痫模型海马神经元的保护作用

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1、学校代码10459学号或申请号201622444023725密级公开专业硕士学位论文A型肉毒毒素鼻腔给药对氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型海马神经元的保护作用作者姓名：黄智导师姓名：连亚军教授专业学位名称：神经病学硕士培养院系：第一临床医院完成时间：2018年3月Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMaster（doctor）TheProtectionofBotulinumNeurotoxinAonHippocampalNeuronsinLithiumChloride-Piloca

2、rpineRatEpilepticModelviaIntranasalAdministrationByZhiHuangSupervisorProfessorYajunLianDepartmentofNeurologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMarch2018A型肉毒毒素鼻腔给药对氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型海马神经元的保护作用硕士生黄智导师连亚军教授郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052摘要研究背景：癫痫（epilepsy）是一种常见的神经系统疾病，频发的癫痫发作可导致脑部严重的损害、意外伤害及

3、精神创伤等，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。目前我国的癫痫的患病率约7.2‰，存在900余万的癫痫患者，虽经正规的抗癫痫药物治疗，仍有近1/3患者的癫痫发作难以得到有效的控制，发展为难治性癫痫，其中颞叶癫痫（Temporallobeepilepsy,TLE）是最常见的难治性癫痫。氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型是Honchar于1983年首次报道，该模型与人类颞叶癫痫模型在神经电生理、神经元损伤、行为学表现等方面相似，是目前研究颞叶癫痫和癫痫持续状态常用的动物模型之一。A型肉毒毒素（BotulinumneurotoxinA,BoNT/A）是一种由厌氧梭状芽孢杆菌产生的神经

4、毒素蛋白，可特异性酶切突触囊泡转运相关蛋白，进而抑制突触前膜神经递质释放，抑制Na+通道，降低神经元兴奋性，为抗癫痫作用提供了理论依据。近来研究表明颅内海马区注射肉毒毒素（Botulinumneurotoxin,BoNT）可抑制急性期癫痫发作，减轻海马神经元损伤，减少慢性期癫痫发作频率，进一步证实了BoNT可作为一种潜在的抗癫痫药物。然而，既往的研究均采用颅内注射给药方式，存在创伤性、操作复杂、易感染、不利于长期给药等弊端，且未进一步探讨BoNT的作用机制。相较于颅内注射，鼻腔给药是一种方便、无创性的给药方式，并可绕过血脑屏障，快速进入中枢神经系统，满足了慢性疾病需长期

5、给药的需求。目前对BoNT/A抑制癫痫发作的具体机制、能否通过I鼻腔给药减少癫痫持续状态诱发的神经元损伤，还有待进一步研究。研究目的：本课题通过观察氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元形态学及自噬、凋亡相关蛋白Beclin-1、Bax,Caspase-3及Bcl-2表达水平的改变，探讨癫痫诱发神经元损伤的机制；探究鼻腔滴注BoNT/A给药方式的可行性，观察其对致痫大鼠行为学、神经元损伤的影响，并检测凋亡自噬、凋亡相关蛋白表达水平，探讨BoNT/A神经保护作用的潜在机制。材料与方法：120只健康雄性SD大鼠，6-7周，220g-250g，随机分为CON组（正常大鼠）、PILO组

6、（致痫大鼠）、PILO+NS组（致痫大鼠+鼻腔滴注生理盐水）和PILO+BoNT/A组（致痫大鼠+鼻腔滴注BoNT/A），PILO组包括3h、8h、24h、72h亚组。PILO+NS、PILO+BoNT/A组大鼠腹腔麻醉后取仰卧位，给予鼻腔滴注等量生理盐水或BoNT/A预处理，CON、PILO组同期仅给予腹腔麻醉处理，并记录各组大鼠体重变化。给药后第50天，四组大鼠给予腹腔注射氯化锂（3mEq/kg），20小时后，CON组腹腔注射生理盐水，余腹腔注射匹鲁卡品（30mg/kg）。大鼠癫痫发作持续60min后，腹腔注射水合氯醛（0.3mg/kg）终止发作。根据Racine痫

7、性发作等级标准，Ⅳ或V级发作判定为造模成功，记录各组造模成功率及潜伏期。造模成功后PILO组3h、8h、24h亚组于癫痫发作终止后各时间点断头取脑，分离海马，采用Westernblot法检测相应蛋白浓度，72h亚组于发作终止72小时后麻醉、灌注取脑，制作石蜡切片，采用尼氏染色检测海马神经元损伤。PILO+NS组、PILO+BoNT/A组于癫痫终止后24小时取海马，采用Westernblot法检测相应蛋白浓度，剩余大鼠在SE后72小时麻醉后灌注取脑，制备石蜡及冰冻切片，观察神经元损伤、检测cleaved-SNAP-25。结果：1.行为学观察