医药学医学毕业论文 链置换扩增术（sda）及其进展

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1、湖南师范大学本科毕业论文考籍号：XXXXXXXXX姓名：XXX专业：医药学医学论文题目：链置换扩增术（SDA）及其进展指导老师：XXX二〇一一年十二月十日关键词：链置换扩增术；DNA检测　　摘要链置换扩增术（stranddisplacementamplification,SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进

2、行，使靶序列被高效扩增。本文主要介绍SDA的原理及其发展。　　关键词链置换扩增术；DNA检测　　近几年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸（DNA或RNA）检测的诊断方法（如各种PCR、Southern杂交和Northern杂交）已大量建立并获得广泛应用。这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点，如：需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛；因此，众多学者学者不断改进现有技术探索新方法。新技术如转录依赖的扩增系统（TAS）、自主序列复制（3SR）、循环

3、探针反应、Qβ复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆续出现。SDA就是在这样的背景下产生发展起来的，与其它的DNA扩增技术相比，SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。　　1992年，美国BectonDickinson研究中心的Walker等发表了关于SDA的研究报道，标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生[1]。人们也在不断对SDA进行改良。用BsoBⅠ代替HincⅡ和采用exo-Bca酶代替exo-Klenow酶建立了嗜热SDA（thermophilicsDA），并以荧光偏振（FluorescencePolarization,FP）

4、检测技术代替电泳法作为SDA产物检测方法，使SDA检测更快速、灵敏且可定量。　　2SDA的原理　　SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术[1]。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。　　SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶，如HincⅡ、HindⅡ；所用DNA聚合酶有链置换生活，但没有核酸外切酶活性（如cxo-

5、Klenow）。因为3’→5’外切酶活性会使引物单链在反应中降解；5’→3’外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5’悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应：①无外切核酸酶活性；②于缺口处启动反应；③可利用dNTPas;④具有链置换活性。以上两种酶最好是耐热毒，如BsobⅠ和exo-Bca酶，以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高SDA的特异性。应用BsoBⅠ和exo-Bca酶的SDA称嗜热SDA，能于20分钟内将靶DNA扩增1010倍，所用dNTP中有一种是经化学修饰的核苷酸（如dCTPas）一根据所用核酸内切酶的不

6、同而不同。采用修饰核苷酸的目的是在SDA中形成修饰的核酸内切酶识别位点，使核酸内切酶不能切断双链DNA而只将其打开缺口。所用两对引物（B1，B2与S1，S2）中有一对（B1，B2）只含与靶片段互补的序列，而另一对（S1，S2）除含与靶片段互补的序列外，还在其5’端含所用核酸内切酶的识别序列（如BsoBⅠ的识别序列为5’-TCGGG），且S1（S2）在模板上的结合位点位于模板上B1（B2）结合位点的5’侧。　　2.1制备单链DNA模板用热解链法制备单链DNA模板可避免影响SDA体系的pH。其它制备方法如酶解链法未见报道。该阶段实际上只是在为SDA准备模板

7、。　　2.2两端带酶切位点的目的DNA片段的生成该阶段通过3次引物延伸和2次置换反应，以单链DNA为模板制备两端酶切位点的双链DNA片段。B1（B2）与S1（S2）分别结合在模板上相应结合位点并在DNA聚合酶作用下延伸其3’端；在B1（B2）延伸的同时，将由S1（S2）延伸所形成的链置换下来；置换下来的链（T1）的5’端含S1（S2）序列，继续参与反应：而B1（B2）与原始模板形成的双链则不再参与反应。T1含B2（B1）和S2（S1）的互补序列，与B2（B1）、S2（S1）结合并经特定DNA聚合酶的延伸和替换，获得一条5’端S2（S1）序列且3’端含S

8、1（S2）互补序列的单链DNA（T2）。B2（B1）与T1形成的双链亦不再参与反应。T2再与S