木质纤维素水解液中抑制剂对丙酮丁醇梭菌发酵产正丁醇的胁迫机制研究

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1、ｓＴｌＡｈＪＪＩｒｊＵＮＩＶＥ中国第－所现代大学Ｒ５ＩＴＹＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士学位论文一级学科化学工程与技术：学科专业：生物化工作者姓名：刘欢欢指导教师：＿ｉＭ天津大学研究生院２０１７年５月木质纤维素水解液中抑制剂对丙酮丁醇梭菌发酵产正丁醇的胁迫机制研究StressmechanismoftheinhibitorsinlignocellulosehydrolysatesonthebutanolproductionbyClostridiumacetobutylicum一级学科：化学工程与技术学科专业：生

2、物化工研究生：刘欢欢指导教师：闻建平天津大学化工学院2017年5月摘要本文采用系统生物学方法，研究了木质纤维素水解液中的抑制剂对丙酮丁醇梭菌发酵产正丁醇的胁迫机理，为菌株进化、木质纤维素水解工艺和发酵工艺改造提供了理论依据。首先我们宏观考察了木质纤维素水解液中普遍存在的三类抑制剂—呋喃、弱酸和苯酚等胁迫下，菌株发酵产正丁醇的动力学行为。结果显示，木质纤维素水解液中对菌体毒性最大的抑制剂为甲酸和苯酚，0.5g/L的甲酸或苯酚足以显著抑制正丁醇生产；而呋喃类化合物在低浓度时（糠醛或5-羟甲基糠醛浓度小于1g/L时）可促进菌体生长和正丁醇生产，当浓度高于1g/L以后

3、，其对正丁醇发酵的抑制效应凸显。为解析抑制剂胁迫下与菌体生长和丁醇生产相关的胞内代谢机制，我们选取了具有代表性的糠醛（1.5g/L）、甲酸（0.5g/L）和苯酚（0.5g/L）作为木质纤维素水解液中主要抑制剂，分别进行了比较代谢组学研究，并鉴定出了对抑制剂的胁迫响应具有密切联系的胞内代谢物。结果表明：3种抑制剂均对胞内氨基酸代谢、糖代谢、二碳代谢和脂肪酸代谢造成显著影响。特别地，糠醛的添加还显著影响了胞内还原性化合物相关的代谢模块；苯酚影响显著的为脂肪酸代谢和核酸代谢；而甲酸胁迫下，胞内代谢活动明显紧缩，造成菌体及正丁醇合成受阻。由于胞内代谢改向取决于胞内的酶

4、和蛋白变化，我们进一步分析了这三种抑制剂胁迫下的胞内蛋白组轮廓。结果发现涉及下游糖酵解、还原-TCA循环、ATP合成、丙酮-丁醇合成、氧化还原相关的关键酶/蛋白含量均较对照组低，解释了胞内代谢胁迫机制及丁醇低产原因；而糖异生、氧化-TCA循环、核酸代谢、脂肪酸合成、含硫氨基酸合成、负责氧化应激的TPX蛋白以及分子伴侣（DnaK，GroEL及HtpG）等蛋白表达均显著上调，表明抑制剂胁迫诱发了菌株的应激响应及代谢调整机制。特别地，在苯酚胁迫下，尼克酸代谢、细胞壁合成、芽孢合成及鞭毛合成等蛋白表达模式与甲酸和糠醛胁迫具有明显差异；而甲酸和糠醛胁迫下的这些模块蛋白表

5、达模式较为接近，表明了这三种抑制剂胁迫机理的特异性。最后，针对木质纤维素水解液中种类丰富且毒性较大的不同结构的酚类物质，我们选取了其中四种具有代表性的化合物（香草醛、丁香醛、阿魏酸和p-香豆酸），对它们的胁迫机制进行了全基因组的RNA-Seq转录组分析。结果显示，四种酚类化合物均对中心碳及能量代谢具有较强的抑制；而对硫代谢、半胱氨酸/甲硫氨酸合成、脂肪酸合成、核黄素合成、乙醛酸合成、RNA降解及磷酸戊糖途径I中的关键基因均具有激活效应。特别是，芽孢形成和嘌呤代谢仅在丁香醛和香草酸胁迫下被激活；与压力应激相关的分子伴侣仅在香草醛、阿魏酸和p-香豆酸中被激活；甘油

6、酯合成相关基因也仅在香草醛、丁香醛和阿魏酸中的表达水平显著下调。以上结果表明四种酚类化合物在菌体的胞内代谢调整与转录调控机制上具有明显的共性，也具有各自的特异性，这为针对木质纤维素水解液中酚类抑制剂的菌株耐受性强化提供了改造依据。关键词：木质纤维素水解液，抑制剂，生物丁醇，系统生物学，丙酮丁醇梭菌IIABSTRACTClostridiumacetobutylicum,knownasitsexcellentethanol-acetone-butanolproducingcapacity,isinvestigatedatthepresenceofdifferent

7、inhibitorsinthelignocellulosehydrolysatesbythemethodofsystemsbiotechnologies.ThesystematicanalysisofC.acetobutylicumresponsetotheinhibitorstress(furans,weakacidsandphenol)providesatheoreticalbasisforthedevelopmentoflignocellulosepretreatmenttechniques,fermentationtechniquesandstrain

8、evolutioninbio-buta