钙磷骨水泥与复合脱蛋白骨关节移植的成骨能力研究.doc

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1、钙磷骨水泥与复合脱蛋白骨关节移植的成骨能力研究【关键词】钙磷　　研制新型的，特别是具有生物活性的人工关节已成为医学工作者面临的重大课题。若能研制出一种与自体骨形态、结构类似的材料及时重建或修复缺损的骨与关节，并能与受体结合，最终存活而成为患者“自身”的材料，这不仅是生物材料学的发展，也必将带来巨大的社会和经济效益。“载体+骨诱导因子（BMP）+生长因子”模式的人工骨已被证实为理想的人工骨生物学材料。笔者设想采用钙磷骨水泥与BMP、TNF-α进行复合，在已钻孔的复合脱蛋白骨关节材料表面涂层及髓腔内填塞，以达

2、到钙磷骨水泥与脱蛋白骨关节移植材料“自锁”。移植后，利用其生物降解特性达到局部持续、高浓度的BMP和TNF-α释放，促进骨愈合。另外，由于钙磷骨水泥无免疫原性，在脱蛋白骨关节表面涂层及髓腔内填充后，是否还可起到早期免疫“封闭”作用，而降低异体脱蛋白骨关节的免疫反应。　　1材料与方法　　1.1材料的制备（1）兔股骨下端脱蛋白骨（DPB）:将新西兰大白兔处死后取双侧股骨下段（保留关节端，长度15mm），经蒸馏水反复冲洗，用20%过氧化氢等反复脱蛋白，乙醚循环脱脂，制成脱蛋白骨关节材料，低温冷冻保存。（2）人重

3、组肿瘤坏死因子（rhTNF-α）:第四军医大学生物化学所提供。（3）人重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）:杭州华东医药集团基因技术研究所提供。（4）钙磷骨水泥（CPC）:上海瑞邦生物材料有限公司提供。（5）DPB/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2/和rhTNF-α粉末按一定比例与重蒸水混合后，在脱蛋白股骨下段髁间钻孔处及近段截骨处四周进行滴注，并置入冷冻干燥机，真空下冷冻干燥后，环氧乙烷消毒。（6）CPC/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2和rhTNF-α粉

4、末按一定比例与CPC固定液混合后，再与CPC粉末进行调和，在未固化前将CPC添入复合脱蛋白股骨下段髓腔内，并在其表面均匀涂层。　　1.2动物模型选取健康成年新西兰大白兔60只（年龄1～1.5岁），雌雄不拘，体重3.0±0.5kg，随机分成A（复合有钙磷骨水泥的异体复合脱蛋白骨关节移植）、B（异体复合脱蛋白骨关节移植）、C（单纯异体脱蛋白骨关节移植）3组。麻醉，暴露股骨远端和胫骨近端，用线锯于距关节面15mm处，锯断股骨，采用张力带钢丝加克氏针固定方法将脱蛋白骨关节固定于断端。复位膝关节，修复关节附属韧带，

5、缝合切口，分笼饲养。　　1.3检测内容5（1）肉眼观察:分别于术后4、8、12、16周处死实验动物，观察骨折愈合情况、局部粘连程度及有无感染、内固定物松动发生，同时在第4周采用游标卡尺测量DBP表面纤维组织包裹厚度。（2）X线照片:各组分别于术后4、8、12、16周于麻醉后行膝关节正侧位摄片。（3）组织学检查:标本截自骨断端和股骨外侧髁关节面，常规切片、HE染色，光学显微镜下观察。（4）透射电镜检查:将标本于3%戊二醛中固定3～4h后，置入0.1%PBS（磷酸缓冲液）中保存，然后EDTA（乙二胺四乙酸）脱

6、钙，锇酸再固定，逐级脱水后环氧树脂包埋，切片，枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色后，H-600型透射电镜观察。　　2结果　　2.1大体观察A、B组:于术后4周时，见脱蛋白骨表面被薄层纤维组织包裹（见表1），骨断端间有纤维组织连接。第8、12周时，骨断端附近逐渐有骨痂形成。至第16周时，骨断端间被大量环形骨痂包绕，脱蛋白骨与受体骨组织紧密粘着，界限模糊，剥离时可见有散在出血点。膝关节腔内有少量纤维组织粘连，脱蛋白骨关节面仍保持光滑。A组无感染、内固定松动发生。B组有3例发生移植部位化脓性感染（占15%），并导致内固定

7、松动2例。　　C组:术后4周时，见脱蛋白骨表面被纤维组织包裹。第8、12周时观察到的骨断端间骨痂在形成速度和量上都明显少于A、B组。至第16周时，脱蛋白骨与受体骨组织间的界限仍然清楚，其膝关节腔内情况与A、B组类似。本组有2例发生局部化脓性感染（占10%），其中1例死亡。　　表1第4周时各组纤维组织包裹厚度（略）　　注:1A、B组两样本间差异有非常显著性（P<0.01）;A、C组两样本间差异有非常显著性（P<0.01）;B、C组间差异无显著性（P>0.05）;2采用多样本两两比较秩和检验

8、（Nemenyi法）　　2.2X线照片各组术后X线片均显示骨断端对位对线良好。　　A、B组:术后第4周时，见骨折线清晰，脱蛋白骨密度较正常骨组织稍高。第8、12周后，骨折线趋于模糊，断端间有骨痂形成。第16周时见骨折线消失，断端间大量环形骨痂形成，骨愈合。脱蛋白骨密度已接近正常骨组织。C组:术后第4、8、12、16周的X线片显示，与A、B组相比其在骨折愈合时间、骨痂形成量上均落后于前两者。第16周时，其脱蛋白骨密度与前并无明显