免疫组化抗原修复的应用进展.doc

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1、免疫组化抗原修复的应用进展作者：吴计生，段淑云，郝建平【关键词】免疫组化；抗原；抗原修复　　［摘要］免疫组化染色技术具有操作简单，灵敏度高，特异性强等优点，绝大多数常用抗体的修复都是通过加热来完成的，可以说抗原热修复是免疫组化的关键技术，会直接影响到最终的染色结果。　　［关键词］免疫组化；抗原；抗原修复　　免疫组化技术具有操作简单，灵敏度高、特异性强等优点。目前已广泛应用于各级医院的临床病理诊断、研究等相关学科中，但由于实验条件的差别及其他技术因素的影响，使得免疫组化染色结果差别很大，从而影响到病理诊断这个“金标准”的含金量，提高免疫组化染色技术水平的需要越来越迫切。　　1　抗原

2、性与抗原修复　　抗原是指能刺激机体产生抗体并能与抗体发生特异性结合的物质，物质所具有的这种特性即为抗原性，它主要由分布在抗原表面的抗原决定簇决定。抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度的恢复过程。　　2　影响石蜡切片抗原性的主要因素　　组织固定对抗原性的影响：为了达到保存良好的组织形态结构，防止组织自溶和保存某些特殊抗原的目的，需要对组织进行及时固定，固定对抗原性的影响主要表现在3个方面：固定不足，使组织中心部位的一些抗原溶解、弥散、丢失；固定时间或浸泡在固定液中过久导致抗原性降低，固

3、定时间越长，抗原被掩盖的程度越重，免疫组化染色结果越差；固定液的种类、浓度对抗原性的影响，甲醛、醇类等不同种类的固定液对不同抗原的固定效果不同，采用微波(MicromaveMV)辐射辅助生理盐水等固定，可获得良好的免疫组化染色效果，同时，制片过程中的脱水、透明、浸蜡、烤片，阻断剂H2O2、甲醇、抗原暴露及修复过程中用的蛋白酶、酸、缓冲液等各种理化因素，都会使抗原受到影响，导致抗原决定簇不同程度的破坏甚至完全破坏，丧失原有的抗原性，因此，需要进行免疫组化标记的材料，从取材制片到染色全过程都应尽量减少人为因素对抗原性的不良影响。　　3　抗原暴露或抗原修复的原理　　1991年，获得了“

4、甲醛对蛋白的改建可以在高温120℃及酸碱作用下复原”，这一重要线索成功地创造了抗原修复技术(Antigenretricral，AR)，该技术被誉为“免疫组化染色的一次革命”3，迅速在世界范围内推广。AR的问世，不仅使一大批抗体摆脱了只能用于冰冻切片的局限，而且在免疫组化标准化进程中显示出举足轻重的作用。目前的研究结果证明：对于绝大多数抗体，AR优于酶消化法；AR的效果取决于两个最基本的因素，即加热的温度和时间，以及所用AR溶液的酸碱度。根据已有的文献报道推测，AR的原理可能是：解洗脱变性蛋白；水解作用：盐酸、微波缓冲液和湿的高压蒸煮等酸性和高温条件，使醛一氨基、抗原与其他分子间的

5、交联，或由蛋白质一级结构折叠成的三维结构因水解而断裂，暴露被掩盖的抗原决定簇；波场内的离子或极性分子直接碰撞的修复作用。　　4　组织固定时间和所需抗原热修复的关系　　大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也会相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。这就提醒我们在做回顾性研究时，一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有区别的，同等条件下，一定要延长修复的时间或提高修复的温度，才能得到比较满意的结果。　　5　不同pH值抗原修

6、复液对染色结果的影响　　抗原修复中所使用的修复液pH值也会对染色结果产生相当大的影响。研究发现在高pH值约pH8.0～9.0时，都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高pH值的修复液，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部和选用高pH值修复液来代替目前广为使用的pH6.0枸橼酸缓冲液。经验证明，绝大多数抗体使用高pH值的修复液效果都要优于pH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体,所以在常规的免疫组化工作中，使用高pH值的抗原修复液可能是今后的趋势。　　6　抗原热修复的方法　　目前抗原热修复所采用的方法主要有微波修复和高压修复两种。由于高压修复温度均一，节

7、省时间、定位准确、染色均匀、结果可靠等特点，已经越来越受到人们的青睐。据报道，2005年至2006年北京市举办的历次免疫组化测评活动表明，凡采用高压修复的单位都以绝对优势获得了专家及参评各单位的一致好评，尤其是细胞核阳性的抗体，用高压修复方法染色，结果显著优于微波修复。目前，这一方法已被北京市大多数单位认同并接受。　　7　注意事项　　在用高压修复时最好将修复液直接注入高压锅，如果是高压锅内另放容器，容器内加修复液来修复，必须加倍延长喷气时间;喷气时间不少于2min，否则难以取得理