分子生物学基础知识要点

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1、Northernblot：是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因表达的有效手段。与Southernblot相比，它的条件更严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。实验步骤：1.用具的准备2．用RNAZaP去除用具表面的RN

2、ase酶污染3．制胶4.RNA样品的制备5.电泳6.转膜7.探针的制备8.探针的纯化及比活性测定9．预杂交10．探针变性11．杂交12．洗膜13．曝光14．去除膜上的探针15．杂交结果半定量PCR要求比普通PCR更严格一些，另外往往通过转膜后的同位素杂交检测或凝胶成像后的灰度测定比较样品间的差异。半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如β-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另

3、外还要做一个β-actin的内参照对照。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1．实时荧光定量PCR无需内标2．内标对实时荧光定量PCR的影响Sybrgreen（荧光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）检测两种蛋白质相互作用方法1共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析2蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定

4、蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。3免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高4Far-Western  又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离

5、好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。    缺点是转膜前需要将蛋白复性。1.酵母双杂交2.GSTpull-down实验3.免疫共沉淀4.蛋白质细胞内定位RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法1.此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息2.节约了实验所花费的经费和时间。3.只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴

6、趣基因的全长基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt?50－70％GC?Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果注意事项?1.cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(Wuzhensaidinformation

7、isCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame1.?RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。2.在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动3.重叠引物的设计会对全长的产生有帮助4.引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端5.

8、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。步骤cDNA第一条链的合成?cDNA第二链的合成图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息，而是通过分析突