2013基因工程复习题

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1、2013年《基因工程》复习题1.为什么说基因工程技术是上世纪60年代末70年代初发展起来的?因为:(1)1967年发现了连接酶;(2)大肠杆菌的转化技术是1970年获得突破;(3)限制性内切核酸酶的分离始于1970年;(4)Berg在1972年构建了第一个重组的DNA分子。2.重组DNA的含义是什么?将一个生物的DNA片段插入到一个载体中,并引入到另一个生物体中进行繁殖。3.限制性内切核酸酶的切割频率?切割频率是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。假定DNA分子中4种碱基的频率相同,且限制性内切酶的识别位点随机分布

2、,那么任何一种限制酶的切割频率,理论上应为1/4n,n为该限制酶识别的碱基数。4.什么是细菌的限制-修饰系统?它有什么意义?细菌中有作用于同一DNA的两种酶,即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶,这两种酶作用于同一DNA的相同部位,把这两种酶所组成的系统称为R-Msystem。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的R-Msystem。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰,由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割,而外来的DNA在相应的

3、碱基上没有被甲基化,宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我,并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA的限制和修饰作用为细菌提供了保护,它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的修饰实现的。5.碱性磷酸酶的种类、差别及用途?CIP的活性比BAP高10-20倍,且加热到68℃就可完全失活,而BAP却是耐热酶,耐酚抽提。用途:(1)dsDNA的5’端脱磷酸,防止线性载体DNA的自身环化。(2)DNA和RNA脱磷酸后,用于多核苷酸激酶进行5’末端标记。【3.基因工程中,为什么不喜欢用BAP来脱去DNA的5’端的磷酸基团?CIP的

4、活性比BAP高10-20倍,且加热到68℃就可完全失活,而BAP却是耐热酶,耐酚抽提。】6.如何利用T4DNA聚合酶制备平末端?T4DNA聚合酶具有5,-3,合成酶活性和3,-5,外切核酸酶活性,并且在高浓度的dNTP存在时,降解作用即会停止。根据这一特性可以调整反应条件,用T4DNA聚合酶的3,-5,外切酶活性将具有3,突出末端的双链DNA切成平末端;用T4DNA聚合酶的5,-3,合成酶活性将具有5,突出末端的双链DNA填补成平末端。(而Klenow酶是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶水解之后,产生的分子量为7

5、6kDa的大片段分子。Klenow酶仍具有5,-3,的聚合酶活性和3,-5,的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5,-3,的核酸外切酶活性,且3,-5,的核酸外切酶活性很弱,故仅可对3’,-隐蔽末端的双链DNA填补成平末端。)7.理想质粒载体必须具备的条件?(1)具有复制起点,这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件,可使繁殖后的细胞维持一定的质粒拷贝数。(2)带有抗菌素抗性基因,最好具有两种抗菌素抗性基因,且抗性基因内有若干单一的酶切位点,便于利用插入失活法筛选重组体。(3)具有若干限制酶单一识别位点,这样可以有选择地供带有不同末

6、端的外源DNA定点插入。(4)较小的分子量和较高的拷贝数,小分子量的质粒易于操作,更能抵抗机械剪切力的切割,可容纳外源DNA片段也更长(不超过15kb),且可有效地转化给受体细胞;小分子量的质粒往往属于松弛型质粒,在细胞中拷贝数较高,扩增后回收率高。8.质粒改造包括哪些基本内容?a.删除一些非必要区段及对宿主有不良影响的区段,削减载体分子量,使载体具有更大的容纳外源片段的能力;b.加上易于选择或检测的标记;c.限制性内切酶酶切位点的改造,便于外源基因插入到载体中的特定位置;d.加上一些调控元件,有利于克隆基因的表达;e.安全

7、性改造,限定载体的宿主范围。9.为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?野生型的λ噬菌体DNA,分子量大,对常用的核酸内切限制酶具有过多的酶切位点(如5个EcoRⅠ限制位点,7个HindⅢ限制位点),没有选择标记,而且具有感染性,显然它本不适于用作基因克隆的载体,因此有必要将λ4噬菌体的非必要(J基因到N基因)区段和多余的酶切位点进行删除,以便改造成适用的克隆载体。1.黏粒载体具有哪些特点与不足?a.柯斯质粒载体具有质粒复制子,因此进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制,并且能在氯霉素作用下进一步扩增。b.具有质粒载

8、体的抗生素抗性基因。c.具有λ噬菌体的包装和转导特性。d.容载能力大。克隆的最大片段为45kb,最小片段为19kb。用cosmid进行克隆时有两个缺点:(1)两个或多个cosmid分子之间的重组,即自我重组降低了重组率。(2)两个或多个外源DNA片段同时插入。2.PCR的基本原理是什么?P

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