《分子生物学》教案

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1、《分子生物学》教案EDNA复制教学目的和要求1理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制2掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质3了解细胞周期4了解真核生物DNA复制的特点E1DNA复制概述半保留机制DNA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生DNA的一条链是原来的旧链，另一条是新合成的，为半保留复制。Meselson和Stahl(1958年)用实验证明了该机制（见教材P71）。亲代链分开及新生DNA开始复制处称为复制叉。DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸（dNTP）:dATPdGTP、dCTP、dTTP。合成的能量来自dNTP的水解。复制子、复制起始与终点以单一单位复制的任一段D

2、NA都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点，原核生物许多病毒的DNA呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点，起始点在最初解链处富含AT序列，它比富含GC的起始点更易解链。半不连续复制由于DNA新链合成只允许以5/→3/方向进行，而两条亲本链反向平行，因而一条新链从起始点按5/→3/方向连续合成（前导链），另一条新链（后随链）从复制叉开始按5/→3/方向先合成一些短的DNA片段（冈崎片段），再由连接酶连成一条连续的DNA。即前导链连续合成为长链，后随链则是间断合

3、成的，这种合成方式为半不连续复制。RNA引导在每一片段的5/端先合成一小段RNA（引物），引导DNA合成。E2细菌的DNA复制起始E.coli的起始点位于遗传基因座oriC，大肠杆菌编码的蛋白DnaA首先识别和结合于oriC的9bp重复序列形成复合物，约45bp成为单链，DnaB进入，它是DNA解旋酶，利用ATP水解产生的能量解开双链DNA，形成的单链泡被单链结合蛋白Ssb所覆盖。DNA引发酶结合到DNA上并合成引物RNA。解旋DNA解旋酶沿模板链前进，打开双螺旋使复制顺利进行，在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过Ⅱ型拓扑异构酶即DNA旋转酶的作用而释放。延伸DNA聚合酶Ⅲ的全酶二

4、聚体引发体和DNA解旋酶结合成复合体（复制体），以每秒900bp的速率合成DNA。引发体含有DnaB解旋酶和DNA引物酶，在后续链上间断合成RNA引物。DNA聚合酶Ⅲ催化合成DNA，该酶含有聚合酶α亚基和一个3/→5/外切核酸酶ε亚基。DNA聚合酶Ⅰ负责切除引物并填补缺口，该酶具有5/→3/聚合酶、5/→3/外切核酸酶及3/→5/校正外切核酸酶活性。DNA连接酶填补片段间的缺口。终止与分离两个复制叉在oriC约1800的对面相遇。该区域有终止子位点，它们与DnaB抑制剂（tus基因的产物）结合，阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链DNA由拓扑异构酶Ⅳ（一种Ⅱ型拓扑异构酶）解联，分配到两个子

5、细胞。E3细胞周期细胞周期细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期，它包括DNA的复制和细胞分裂。细胞周期分4个时期：G1期—细胞为复制作准备；S期—DNA复制；G2期—S期后有丝分裂前的短暂期；有丝分裂期—染色体对等分配到两个子细胞，它又有前、中、后期之分。G1、S、G2共同组成间期。有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1期，也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态G0期（沉默期）。检验点及其调控在G1期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点（R点），细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原，若细胞在到达R点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进G0期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点，它在间歇期

6、发生以保证细胞分裂之前完成DNA复制。细胞周期蛋白和CDK蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调节亚基（细胞周期蛋白）和依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）来完成，细胞周期蛋白—CDK复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。E2F和RB的调控由G1期进入S期主要依靠对E2F这一转录因子的激活，E2F的活性又受与其结合的蛋白RB的抑制，在G1中后期，细胞周期蛋白—CDK复合物使RB磷酸化从而释放E2F进而激活转录。细胞周期的激活、抑制和癌症小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK4蛋白可通过抑制细胞周期蛋白—CDK复合物的活性来延迟细胞周期的进程。细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1到S期的过渡受到原

7、癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物—抑癌蛋白RB和P53均与细胞周期调控密切相关，RB调控E2F的活性，当DNA损伤时，P53诱导P21WAF1/CIP1的合成。E4真核生物的DNA复制实验系统仅有400个复制子的酵母，更为简单的猿猴病毒（SV40）病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物广泛用于外加DNA或整个细胞核的复制。起始点