单色荧光标记表达谱芯片

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1、单色荧光标记表达谱芯片实验流程一、准备One-ColorSpikeMix【根据上样量选择稀释步骤】1、将One-ColorSpikeMixstocksolution在vortex上混匀，37度处理5分钟，在vortex上混匀，然后瞬时离心。1、第一次稀释：在第一个管子上标注第一次稀释spike-in，在vortex上混匀spikemix，37度循环水浴中加热5分钟，vortex再次混匀，瞬时离心。在管子中加入2ul的spikemix。再加入38ulDilutionBuffer，vortex混匀，瞬时离心。2、第二次稀释：在第二个管子上标注第二次稀释spike-in，加入第一次稀释液2ul，再

2、加入48ulDilutionBuffer，vortex混匀，瞬时离心。3、第三次稀释：在第三个管子上标注第三次稀释spike-in，加入第二次稀释液2ul，再加入38ulDilutionBuffer，vortex混匀，瞬时离心。4、第四次稀释：在第四个管子上标注第四次稀释spike-in，加入第三次稀释液10ul，再加入30ulDilutionBuffer，vortex混匀，瞬时离心。保存：StoretheAgilentRNASpike-InKit,One-Colorat–70°Cto–80°Cinanon-defrostingfreezerforupto1yearfromthedateof

3、receipt.ThefirstdilutionoftheAgilentOne-ColorSpikeMixpositivecontrolscanbestoredupto2monthsinanon-defrostingfreezerat-70°Cto-80°Candfreeze/thaweduptoeighttimes.一、探针标记1、将25-200ng总RNA加入1.5ml离心管中终体积1.5ul。【RNA保存要浓度大于100ng/ul，使用时再稀释】2、每个管里加入2ul稀释后的spikemix，终体积3.5ul。3、按照下表配制4、每个管中加入1.8ulT7PromoterPrimerM

4、ix，终体积5.3ul。5、65度水浴中10分钟，使引物和RNA变性。6、冰上放置5分钟。7、将5Xfirststrandbuffer于80度预热3-4分钟。Vortex混匀，然后瞬时离心。室温放置待用。1、2、按照上表配制cDNAMasterMix。3、瞬时离心每个反应管，每管中加入4.7ulcDNAMasterMix，用枪混匀，终体积10ul。4、将反应管在40度水浴中，放置2小时。5、然后转入70度水浴中，放置15分钟。6、然后冰上放置5分钟，瞬时离心。保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。7、按照下表配制TranscriptionMasterMix8、每反应管加入6ulT

5、ranscriptionMasterMix，用枪混匀，终体积16ul。9、然后在40度水浴中处理2小时。保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。一、纯化探针【0.5h】1、加84ulnuclease-freewater到cRNA【标记后的探针】中，总体积100ul。2、加入350ulbufferRLT然后用枪混匀。3、加入250ul（96%-100%）乙醇，用枪混匀【此处不离心】。4、将总共700ul体系转入RNeasyminicolumn中，13000rpm，4度离心30秒，弃滤过液。5、将RNeasyminicolumn转入新的收集管中，加500ulRPE，13000rpm，4

6、度离心30秒，弃滤过液。1、再加500ulRPE到RNeasyminicolumn，13000rpm，4度离心60秒，弃滤过液和收集管。2、将RNeasyminicolumn转入新的收集管中，加入30ulRNase-freewater，等60秒后，13000rpm，4度离心30秒。冰上放置滤过液。3、测定标记效率一、芯片杂交1、按如下比例配杂交体系2、60度处理30min，使cRNA片段化，然后迅速冰上处理1min。【不要再这一步停留超过30min。冰上放置或加入2×hybridizationbuffer均可以终止fragmentation过程】3、按下表加入合适体积的2×GExHybrid

7、izationBufferHI-RPM【目的：终止片段化过程】1、用枪混匀【不要用vortex】，一定避免产生气泡。2、13000rpm室温离心1min。3、冰上放置，迅速将杂交液加到芯片上。4、缓慢将杂交液加入gasket小室中。5、将芯片agilent活性面朝下放到gasket上，夹紧chamber。6、65度，10rpm杂交17小时。一、芯片洗涤1、总体步骤如下2、按照商标准备好洗缸，洗缸1和2中加入室