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时间:2018-08-06
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1、细胞的细菌、真菌污染及排除EditByWaiting.D真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防
2、止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。真菌污染 细菌是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象;有时静置的培养液液体初看不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细
3、菌种类;有的培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min,沉淀中加入无抗生素的培养液2ml,置于37℃培养,24h可得结果。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。细菌污染 细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且由于增生迅速,多再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生,有利于及时采取措施予以补救或排除。
4、培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染,可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)(具体操作方法可参考细胞培养污染的预防),复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采用5~10倍于常用量的抗生素冲击,加入高浓度抗生素后作用24~48h,再换入常规培养液,有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。常用抗生素用量和效应抗生素抗菌谱浓度(量/mL)细菌真菌支原体青霉素
5、G+ 100~1000u链霉素G- 100~1000μg庆大霉素G+/G- +50~200μg四环素G+/G- +10~50μg卡那霉素G+/G- +100~1000μg两性霉素 + 常用2μg/mL制霉菌素 + 常用25μg/mL+表示效应程度 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞
6、,稀释到常规细胞传代的浓度。2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0mg/ml。3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6.重复步骤4。7.在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。
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