寡义反核苷酸的设计及使用

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1、Morpholino的设计及使用发育生物学家们（他们所使用的模型动物在遗传学方面的研究往往还不完善，当然有的动物已经研究得很完善了）所面临的很重要的问题之一是如何在生物体发育时期抑制他们所感兴趣的基因的活动——这样一来生物学家们就可以研究这个基因的正常的生物学功能了。一项被广泛接受的方法是反义技术——尤其是反义寡核苷酸（morpholino，简称MO）技术。在本文中，我们将简述该药物（指MO）的使用，并举例说明它们如何应用于发育机制的研究。我们还将讨论怎样应用MO就会导致产生错误的结果——包括没能将目的基因靶向敲除，同时我们建议研究人员使用对照实验，这样就能对MO实验作出

2、正确的解释。简介为了理解发育早期的分子机制，发育生物学家们长期以来一直希望能有这样一种技术，即：可以在特定的发育时期、在特定的细胞中阻断特定的基因的表达。这一目标目前还没有实现，尽管研究人员在小鼠胚胎上已经很接近这一最终目标了——他们使用的方法是靶向突变和Cre重组酶。即便如此，仍有很多困难没有克服：试图干扰某一个基因的功能往往会对另一个基因产生不希望发生的“副作用”，而使用Cre重组酶则需要警惕Cre基因表达时所具有的潜在的毒性作用。其它物种又如何呢？毫无疑问，对其它脊椎动物和无脊椎动物的研究已经深入到了研究在发育早期的基本机制的地步，而且与使用哺乳动物胚胎为研究对象相

3、比，使用这些动物具有很多明显的优势——包括可接受性、成本、时间，此外这些动物本身就很令人感兴趣。在所有这些动物中，目前都还没有建立常规的基因打靶技术。尽管传统的遗传筛查技术在理解某一特定的过程方面具有不可估量的价值，但它既不能保证具体到特定的目的基因，也不能保证使生物体产生一种无效突变。总之，研究人员需要一种能阻断基因功能的方法。显性抑制方法有一定的应用价值，但不是最佳的选择。最佳的选择是具备较高特异性的反义RNA技术。反义RNA技术不但可以用于脊椎动物，还可以应用于组织细胞中，而且它们在寻找新药方面正在发挥越来越大的作用。RNA干扰（RNAi）和寡义反核苷酸（MO）技术

4、对我们理解胚胎发育早期基因的功能有巨大的影响。但这两项技术是否是已经好的足够可信呢？所有的反义技术都存在“脱靶”的可能。这些副作用让人们很难判断最终出现的表型究竟是靶基因被敲除所导致的还是靶基因以外的其他基因被敲除所导致的。要理清这一问题需要进行全面而又严格的对照试验。在这里，我们将讨论用反义技术（主要集中在MO实验及其对照）研究动物发育时采取何种对照试验较为合适，并针对在斑马鱼和青蛙中进行上述对照实验时提出了若干建议。这些问题在进行针对果蝇和哺乳动物细胞的RNA干扰实验时就已经被讨论过。在进行针对其它物种的MO实验以及治疗应用时，我们所提出的有关对照试验的部分建议仍然是

5、很重要的。反义技术将反义RNA导入细胞以阻断内源性mRNA的翻译、加工或其稳定性的设想是在20多年以前提出来的。这项技术已经被证明能够成功地抑制外源性RNA（注射到非洲爪蟾卵母细胞中的外源性RNA）的翻译过程，同时也能抑制内源性mRNA的翻译。而由Heasman和Wylie于1997年开发的反义寡核苷酸技术则能够让研究人员研究青蛙卵母细胞中从母体遗传来的基因转录本的功能（例如包括Vg1和VegT基因编码的转录本）。在上述例子中，这些反义药物是通过与内源性的RNA杂交并通过核糖核酸酶H（RNaseH）介导这些内源性RNA的降解而干扰基因的功能的。令人惊讶的是，在秀丽隐杆线虫

6、（Caenorhabditiselegans）中进行的研究表明，双链RNA同样可以干扰内源性基因的功能。这一工作导致了动物体内小的、非编码的RNA家族的发现（这些RNA可以调节许多——如果不是全部的话——基因表达方面的功能）。2006年的诺贝尔奖就授予了“双链RNA介导干扰”这一现象的发现者。至少在青蛙中，除少数例外情况外，在用传统的反义RNA、反义寡核苷酸或RNA干扰的方法研究青蛙受精卵中表达的基因的作用时并未获得成功。与之相类似，在斑马鱼中，反义RNA作用的特异性太低，以致这一技术无法实际应用于针对斑马鱼发育过程中某一特定基因的功能的研究。也许以后会有新的方法使上述技

7、术（如RNA干扰）在青蛙和斑马鱼中的应用成为可能，但目前看来这些技术还是不实用的。在确定基因功能时所遇到的这些问题阻碍了发育生物学的发展。直到本世纪初，人们才欣喜地发现寡义反核苷酸（MO）能够在青蛙和斑马鱼体内将特定的基因靶向敲除。MO在研究基因功能方面的威力迅速被人们所知晓并在其它生物体中得以推广应用，包括热带爪蟾、鸡、海鞘、家鼠的卵母细胞以及紫色海胆。2001年7月的《遗传》杂志（journalGenesis）用一整期特刊的形式通报了MO技术在推动发育生物学发展方面的重要性，这一期特刊全部用于介绍在多种生物体中应用MO进行