蛋白质间相互作用研究方法--技术流

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1、蛋白质间相互作用研究方法--技术流确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质..双杂交和其他双成分系统第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定诱饵-LexA融合蛋白的构建1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：a.pBait+pMW12（活化测定）b.pSH17-4+pMW12（活化的阳性对照）c.pRFHM1+pMW12（活化的阴性对

2、照）d.pBait+pJK101（抑制/DNA结合测定）e.pRFHM1+pJK101（抑制的阳性对照）f.pJK101单独（抑制的阴性对照）3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e）或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化酵母克隆。4．制备转化子的母板。活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析5．从a~f的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约8个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的CM(Glu)-Ura-His或CM(Glu)-Ura平板上划1

3、cm长的线，30℃孵育过夜。6．第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：转化a~f：划线到CM(Glu,X-gal)-Ura和CM(Gal,X-gal)-Ura上转化a~c：划线到CM(Glu)-Ura-His-Leu和CM(Gal)-Ura-His-Leu上7．30℃将平板孵育到4天。8．对抑制和激活性进行分析：a.对于抑制活性，在划线接菌12～24h时观察X-gal表型。b.对于激活性，在划线接菌18～72h时观察X-gal表型。c.在48～96h之间观察Leu表型。9．基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。检测诱饵蛋白质表达10．在母板上，标记要分析蛋白质表达的

4、克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。11．对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。12．转移1.5ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞3～5min。可见沉淀的体积2～5μl。小心倾去或吸除上清。13．加入50μl的2×SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。14．将样品从干冰或-70℃直接转到100℃，并煮沸5min。15．将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心5～30秒。加20～50μl样品到SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳

5、道中。16．电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。17．为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。第二阶段：筛选一个相互作用子转化文库1．挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子的酵母菌落，接种于20mlCM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30℃摇动过夜培养。2．稀释20ml的过夜培养物于300ml的CM(Glu)-Ura-His液体培养基中至OD600约为0.10～0.15。在旋转摇床上30℃摇动培养，直到OD600达到0.50左右。3．把培养物转移至1个250ml的无

6、菌离心瓶中，室温下1000～1500g（使用SorvallGSA转子2500～3000r/min）离心5min。移去上清，加入30ml无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50ml的无菌Falcon管中。4．1000～1500g（同上）离心酵母细胞5min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5ml含0.1mol/L乙酸锂的TE(pH7.5)中。5．在30个1.5ml的无菌小离心管中分别加入1μg的文库DNA和50μg刚刚变形的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50μl的酵母悬浮液。6．在每管细胞悬浮液中加入300μl含40%PEG4000和0.1mol/L

7、乙酸锂的无菌TE(pH7.5)，混合（不要振荡），30℃培养30～60min。7．每个试管中加入40μlDMSO，翻转混匀悬浮液，在42℃的加热块上加热10min。8．转化混合物铺平板：其中的28管用于产生转化子：把每管混合物加到24cm×24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，将细胞涂匀，将板30℃孵育至菌落出现。剩余2管：每管取350μl混合物加到24cm×24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，30℃培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的40μl混合