应用蛋白质化学材料

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1、无细胞蛋白表达系统的应用无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。无细胞蛋白质合成体系以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。抗体在治疗、诊断和应用研究领域都起着重要作用，抗体也是检测生物靶标的重要物质。在临床试验中使用的药物制剂中约有30%为基因工程抗体。抗体在诊断和治疗中的重要作用促进了生产高特异性抗体的方法和技术的巨大发展。利用杂交瘤技术生产

2、抗体以及利用原核细胞和哺乳动物细胞生产抗体或抗体片段技术已经发展的相当完善。然而，基于细胞的蛋白生产比较耗时，花费也高，高效的无细胞蛋白合成体系应运而生。在过去的十年里，无细胞蛋白表达系统已成功生产了不同来源各种特性的多类蛋白，被证明是可靠、灵活和高效的蛋白生产平台。无细胞蛋白表达体系已经成功的生产出完整抗体和抗体片段。无细胞蛋白表达系统合成二硫键蛋白：抗体是较为复杂的蛋白分子，包含两条同样的重链和轻链。每条抗体链都包含清晰的功能域，其中β-折叠以二硫键相连，形成β桶状。二硫键对抗体的折叠和功能起

3、着重要作用。因此，无细胞蛋白表达体系需要提供能够形成二硫键的环境以表达功能抗体。  在过去的十年里，无细胞蛋白体系已经成功表达了二硫键蛋白。最初无细胞蛋白体系表达二硫键蛋白时遇到的两个障碍是，第一，还原剂如DTT通常加入体系中以保持细胞裂解液在储存和翻译过程中的活性；第二，缺乏活细胞内那样具有氧化还原条件的区室（如原核细胞中的细胞周质，真核细胞中的内质网）以供二硫键形成。根据细胞裂解液的来源，采取了不同策略。例如，大肠杆菌裂解液中添加入还原性和氧化型谷胱甘肽的混合物以建立合适的高氧化还原电位。其他

4、翻译系统主要采用烷基化试剂如碘乙酰胺对裂解液进行预培养以灭活内源性还原酶。由于碘乙酰胺的使用可能会导致翻译活性的下降，因而发展了其它预处理方法如使用过量的氧化型谷胱甘肽。进一步研究发现，加入外源性的酶，如真核蛋白二硫键异构酶（PDI），能够显著提高无细胞蛋白体系合成scFv片段的功能。加入分子伴侣如DnaK，DnaJ,GroEL和GroES同样也是有益的，因为这些分子伴侣提高了无细胞蛋白表达系统合成的scFv和Fab的可溶性。  最成功的表达二硫键蛋白的大肠杆菌无细胞蛋白表达系统采取了多种策略共同

5、使用的方法。如，细胞裂解液由突变的大肠杆菌菌株制备，此菌株缺乏一种主要的内源性还原酶（Δ gor strain,无细胞蛋白表达系统的应用无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。无细胞蛋白质合成体系以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。抗体在治疗、诊断和应用研究领域都起着重要作用，抗体也是检测生物靶标的重要物质。在临床试验中使用的药物制剂中约有3

6、0%为基因工程抗体。抗体在诊断和治疗中的重要作用促进了生产高特异性抗体的方法和技术的巨大发展。利用杂交瘤技术生产抗体以及利用原核细胞和哺乳动物细胞生产抗体或抗体片段技术已经发展的相当完善。然而，基于细胞的蛋白生产比较耗时，花费也高，高效的无细胞蛋白合成体系应运而生。在过去的十年里，无细胞蛋白表达系统已成功生产了不同来源各种特性的多类蛋白，被证明是可靠、灵活和高效的蛋白生产平台。无细胞蛋白表达体系已经成功的生产出完整抗体和抗体片段。无细胞蛋白表达系统合成二硫键蛋白：抗体是较为复杂的蛋白分子，包含两条

7、同样的重链和轻链。每条抗体链都包含清晰的功能域，其中β-折叠以二硫键相连，形成β桶状。二硫键对抗体的折叠和功能起着重要作用。因此，无细胞蛋白表达体系需要提供能够形成二硫键的环境以表达功能抗体。  在过去的十年里，无细胞蛋白体系已经成功表达了二硫键蛋白。最初无细胞蛋白体系表达二硫键蛋白时遇到的两个障碍是，第一，还原剂如DTT通常加入体系中以保持细胞裂解液在储存和翻译过程中的活性；第二，缺乏活细胞内那样具有氧化还原条件的区室（如原核细胞中的细胞周质，真核细胞中的内质网）以供二硫键形成。根据细胞裂解液的

8、来源，采取了不同策略。例如，大肠杆菌裂解液中添加入还原性和氧化型谷胱甘肽的混合物以建立合适的高氧化还原电位。其他翻译系统主要采用烷基化试剂如碘乙酰胺对裂解液进行预培养以灭活内源性还原酶。由于碘乙酰胺的使用可能会导致翻译活性的下降，因而发展了其它预处理方法如使用过量的氧化型谷胱甘肽。进一步研究发现，加入外源性的酶，如真核蛋白二硫键异构酶（PDI），能够显著提高无细胞蛋白体系合成scFv片段的功能。加入分子伴侣如DnaK，DnaJ,GroEL和GroES同样也是有益的，因为这些分子伴侣