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1、骨组织工程常用间充质干细胞探究进展胚胎干细胞(ES)与间充质干细胞(MSC)一直是组织工程最为常用的种子细胞。但目前由于ES的分离获取存在医学伦理学的争议,研究受到了一定的限制。而MSC,是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中,在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,同时避免了医学伦理学争议等优点而越来越受到研究者们的青睐。本文就骨组织工程常用MSC的生物学特性及基础
2、与临床应用研究进展作简要综述。1生物学特性分析与比较自1995年Grane提出骨组织工程这一概念以来,经过十几年的研究,骨组织工程在种子细胞、支架材料以及细胞-支架材料复合体等方面的研究取得了很大进展,为临床骨缺损修复重建打下了良好的基础。其中种子细胞的研究与应用主要集中在以下几种间充质干细胞:骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪干细胞、肌源性干细胞等。14MSC是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中。在特定条件下可向骨、软骨、心
3、肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。来源不同的MSCs,虽在生物学特性方面均表现干细胞特性,但相互之间仍有一定差异。目前对于MSCs的生物学特性研究主要集中在以下几个方面:1.1分离培养141.1.1骨髓间充质干细胞(BMSCs):具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,无医学伦理学争议及过大的骨异常增殖趋势等优点,被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。目前分离BMSCs的常用方法有5种:即全骨髓法、密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪法及免疫磁珠法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液弃
4、去不贴壁细胞,从而达到纯化细胞的目的;密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用percoll分离液将其分离出来;贴壁筛选法则是根据BMSCs具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;流式细胞仪分选法则是根据BMSC体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选;而免疫磁珠法则根据细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,用抗体包被磁珠,获得相对纯化的细胞。其中由于经过流式或磁珠分选后的干细胞会出现增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,两者应用并不广泛。目前最为常用分离BMS
5、Cs的方法主要是全骨髓法和密度梯度离心法,由于单独应用时存在获取细胞纯度不够及数量较少等缺陷,近年有人尝试用密度梯度离心结合贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞,效果比较理想[1]。BMSCs一般原代培养接种3～4h后开始贴壁,24h大量贴壁;2～3天见部分集落形成,大多数细胞有胞浆突起;7～10天集落迅速增多,以梭形细胞为主,胞浆丰富、核大、核染色质细、核仁明显,细胞呈平行排列或漩涡状生长;14天左右融合达80%～90%,可进行传代。传代细胞呈均匀分布生长,细胞以梭形为主。BMSC的生长潜伏适应期为
6、1～2天,3天后进入对数生长期,6～7天后进入生长平台期。BMSC倍增时间为30～50h,细胞每传一代,细胞数约增长2倍。不同物种的BMSCs特性不尽相同,不同培养基、血清浓度、细胞接种密度、换液时间、酶消化时间、培养基pH值都会影响其生长[2]。1.1.2脐血间充质干细胞(UC-MSCs):脐带血是脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞(HSCs)和MSCs。与骨髓相比,脐带血有更充足的来源;脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗
7、宿主病(GVHB)发生率较低;其间充质干细胞更为原始,扩增能力更强等优点,故脐血干细胞可作为一种新的替代细胞来源,用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗,它的作用也越来越受到重视[3]。14目前用于UC-MSCs分离的方法同BMSCs基本相同,但UC-MSCs的分离培养和筛选与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、筛选过程中操作技术等多种因素有关,也无统一标准。不同培养基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都会影响细胞的生长。一般原代培养的脐带血间充质干细胞多在培养24～48h后贴壁,1周左右成
8、梭形,并成克隆性生长,4～5周可达80%以上的融合。原代培养的干细胞中可见多核,形态扁平的破骨样细胞混杂,一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞[3]。1.1.3脂肪间充质干细胞(ADMSCs):是指从脂肪组织抽吸物中获得的一种成纤维细胞形态的细胞群,具有取材容易,获得率高,自我更新能力与多向分化潜能类似BMSCs等优势。原代培养细胞呈平行排列,漩涡样生长,细胞多为梭形、多角形等,胞浆和核仁丰富。传代培养中,经过多次传代(10～20代),细
