3ph值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响

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1、pH值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响摘要生产中聚谷氨酸的发酵液非常黏稠(粘度达1．71Pa·s)，这使除茵体提取聚谷氨酸非常困难。通过加酸或碱调节发酵液pH<5或pH>8可明显降低发酵液的粘度(其中pH3．5时粘度仅为pH6．5时的160左右)。将pH3．5的发酵液离心除茵(10000g，10min)后超滤浓缩(滤膜孔径0．45,um，平均压力0．08Mpa)1倍，再加入95％乙醇提取7-PGA，与pH中性时相比，可减少50％以上的能量消耗及40％的溶剂，但聚谷氨酸损失约10％。加酸或加碱处理可使发酵液中

2、7-PGA的分子结构发生改变，分子质量降低，这对生产高分子质量的聚谷氨酸不利，但对生产低分子质量产物是适宜的。关键词聚一谷氨酸，提纯，乙醇沉淀，枯草芽孢杆菌聚7一谷氨酸(7一PGA)是一些芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌等)荚膜结构的主要成分，是一种生物自然合成的聚酰胺原料_8J。由于7一PGA可完全生物降解，对人体无毒，因此被认为是一种良好的生物可降解聚合物材料，可广泛地应用于食品、医药、环保、化妆品及农业等领域[，，。在发酵法生产7-PGA方面，国内外已经有几个研究小组在探索，但在7一PGA的提取方面，研究的人比较少

3、。在芽孢杆菌生长过程中，7一PGA从细胞壁中分泌出来形成菌体的荚膜结构，也可溶解在培养液中。由于7一PGA属于高分子聚合物，分子质量一般在100000～1000000u之间，因此生产上发酵液变得非常粘稠，这一方面影响通风供氧，增加搅拌阻力，另外也给发酵结束后除菌体提取7一PGA带来很大困难。从7一PGA分子单体的结构来看，分子中有游离的羧基，其等电点为3．47J，在7一PGA生产中由于发酵液的pH值接近中性，7一PGA荚膜结构带负电荷，在培养液中很稳定，不易沉降。产荚膜细胞的这种较高的稳定性及发酵液的高粘度，是细

4、胞分离和7一PGA提取中存在的突出问题。降低产荚膜细胞的稳定性及发酵液的粘度是解决问题的关键所在。1材料和方法1．1材料1．1．1菌种枯草芽孢杆菌B53，从瓜汁中分离得到并进行了鉴定。1．1．2培养基和培养条件(1)种子培养基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，NaCI10g／L，葡萄糖1g／L，蒸馏水配制，调pH7．2，0．1MPa灭菌20min。(2)发酵培养基：L—Glu20g／L，CTA9．86g／L，Glycerol80．36g／L，(NH4)2S047g／L，MgSO4。7H2O0．5g／L，F

5、eC136H200．02g／L，K2HPO40．89g／L，CaCI20．03g／L，MnSO4H2O0．3g／L，蒸馏水配制，用NaOH调pH6．5，0．1MPa灭菌20min。基本发酵条件：采用300mL三角瓶装液量50mL，种子液24h，接种量4％(V／、厂)，摇瓶转速150r／min，37℃振荡培养96h。此条件下可生产20～25g／L的7一PGA。1．2方法1．2．17一PGA的提取及测定方法7-PGA含量的测定参考文献[1]。1．2．2发酵液动力粘度的测定发酵液经离心除菌后(离心转速20000×g，2

6、0min)，采用SNB一1数字式粘度计测定上清液粘度。选用3号转子，转速12r／min，25℃下测定。1．2．3发酵液pH值的测定酸度计法。1．2．4超滤方法采用配备0．2m、0．45m滤膜的小型超滤系统，20～25℃，压力0．05～0．10MPa。1．2．5SDS-PAGE电泳方法采用DYC23B型电泳仪(北京六一仪器厂)，分离胶10％，浓缩胶5％，电泳条件为操作电压80V，稳压3h，标准蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，PGA用阿利新兰8GX染色，其他参考文献[93进行。1．2．6显微观察采用显微摄像系统(Mo

7、ticBSeries／Panasonic)。2结果与讨论2．1pH值对PGA发酵液动力粘度及产物回收的影响取发酵液280mL，分装8个三角瓶中，用6mol／LHCI或6mol／LNaOH分别调pH值为3．0、3．5、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0和9．0，然后在25℃及45℃下分别测定动力粘度(如图1)。取上述不同pH值的无细胞培养液各10mL，分别加入95％乙醇25mL，振荡后离心15min(10000×g)，称量沉淀物湿重(一次提纯)，再将沉淀物各加5mL去离子水溶解，再分别加入15mL95％的乙醇，

8、振荡后离心15min(10000×g)，再称量沉淀物湿重(二次提纯)。结果如图2所由试验结果看出，pH值与温度对发酵液的粘度有较大的影响。在pH>4时，温度对粘度的影响是明显的，而pH<4时，温度对粘度的影响可以忽略；同温度相比，pH值对发酵液粘度的影响更为显著，在pH中性时，发酵液的粘度最大，加酸或加碱都可使发6l2—006Vo1．32No—．1O(Total226)酵