神经元培养 -总结

《神经元培养 -总结》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Coverslips的清洗方法1.三蒸水浸泡过夜2.硝酸浸泡48小时,硝酸每月更换一次。（18h<时间<72h）3.先用单蒸水冲洗几遍，将表面的硝酸洗去，然后用双蒸水洗8次，在摇床上摇90-100转，1小时换一次水。最好能摇过夜。4.干烤6小时，干烤温度为225度。注：洗玻片这一步很重要，如果洗不彻底，细胞贴壁明显不好，并有聚团现象。洗得过程中，请按照先放水，再放入玻片架，以免玻片互相粘在一起，洗不彻底。换水时用PE手套，每次换水请更换PE手套，如洗的过程中有粘在一起的现象，请用镊子一个一个分开后，再继续洗。5.在超净台，放到

2、无菌培养皿里，封口膜封好6.用0.1mg/ml的PLLcoat玻片，每个玻片100-120ul,过夜放置，60mm加3ml，12孔板加1ml。注：PLL最好不要使用超过1个月。母液浓度1mg/ml，-20℃贮存，工作浓度0.1mg/ml（100ul母液+900ulddH2O）7.种细胞前吸去多赖，用HBSS洗，2ml/well，2-3次。注：没有放coverslips的dish不用洗，直接吹干就好了，30min左右。8.在Hood里自然干燥，不开紫外，紫外线可以分解多赖。Preparation:1）冰盒，解剖工具（1把大剪刀，

3、2把尖镊子，2把尖嘴弯镊）泡在75%的酒精中消毒，100mmdish2个，60mmdish4个，细胞计数板，timer，1大1小两个塑料袋。2）4个60mmdish每个放3ml左右HBSS置冰上，1个100mmdish加入20ml左右DMEM全培置冰上。3）打开37°C水浴，pre-warmHBSS，NB全培，0.25%胰酶（trypsin）学生值日准备工作1预先查看是否有NB液及加B27的NB液2查找并确定共需多少皿神经元，注意孵箱里保顾的待培养的皿，24孔板，6孔板等2确定共需配制多少神经元培养液（即10%HS的全培）3吸

4、去待培养神经元的培养皿中的多赖并回收多赖，晾干4配制神经元培养液，并加于各待培养的皿中，24孔板500ul，96孔板100ul神经元基础培养液：NeurobasalMedium+B27(2%，10ml/500mlNB，避光融化)神经元原代培养种植液50ml：DMEM+HS(5ml，10%)神经元培养液：神经元基础培养液+GlutaMAX(125ul，100X，0.25%)+双抗（1%，P-S，无血清）NB，0.25%trypsin，37℃预热。双抗用前解冻，用量可更少，对细胞毒性会更小Dissection：解剖：取3管-20°

5、C保存的trypsin（500ul）放置冰上溶解。1）从动物房拿怀孕18天母鼠，喷洒70%酒精消毒，沿着腹白线剪开腹腔，取出子宫，放入1个100mmdish。2）剪开子宫，取出胎鼠，剪下头，放入有HBSS的100mmdish中.3）取两把尖嘴弯镊，1把夹住眼窝，固定大脑，另1把镊子沿中轴纵向撕开头皮和头盖骨，用镊子在顶部稍加挤压，取出整个大脑，腹部朝上放入装有HBSS的60mmdish中，每个dish装2到3个大脑。速度要快，血液对神经元有伤害。4）在解剖显微镜下，分离大脑半球，剔除脑膜，分离皮层和海马。大致步骤为取脑组织，解

6、剖后剪碎消化，终止消化离心或静置沉降后弃上清，管底组织团块吹2次后合并上清计数后种植Digestion：1）在超净台，将海马剪成2半，并在35mmdish中加入2ml预热好的0.25%的胰酶（进口），37℃培养箱内消化15min，计时。2）将60mmdish中的皮层剪碎后，加入4ml预热好的0.25%的胰酶（进口），37℃培养箱内消化15min，计时。一般1个60mm皿中最多消化8个皮层（即4个全脑）3）消化结束后加入预热的10%HS（1/4体积于trypsin）略摇晃以终止消化，再加入DNAase（1000X）略摇晃（消化掉

7、破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化）。海马：a)消化期间准备3-4个1.5mltube，每只加1ml左右的种植液。b)小心取出dish中消化好的沉淀，加入新的1.5mltube，静置3min，吸出沉淀放入另一个1.5mltube中，共洗2-3遍。c)在最后1个tube中用1ml加样枪轻轻吹打15次左右，静置3min，上清吸入另一空的1.5mltube，离心，1200rpm*3min离去碎片。弃上清，沉淀用种植液重悬混匀。稀释10倍后，进行细胞计数。然后按照要求的密度进行种植。注：吹打时避

8、免产生气泡，胎鼠较小时（<18d）可以多吹打几下。通常一根半侧海马铺一小皿，先接种一皿，显微镜观察。皮层：a)消化期间准备1个15mltube，加2ml左右的全培。b)小心取出dish中消化好的沉淀，加入15mltube中，静置3min，1200rpm*2min离心，轻弃上清