动物疫病检测技术

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1、分子诊断学20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生。70年代以来，分子生物学已成为生命科学领域最具活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床,在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透,产生了一个崭新的学科方向-分子医学;70年代末,美国科学院院士美籍华裔科学家Kan等应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断,标志着检验诊断进入基因诊断时代。由于基因诊断是从疾病基因或与致病相关的基因及其表

2、达产物的水平上进行检测,因此实现了疾病的早期诊断,但由于基因诊断方法以现代分子生物学技术为基础并有机整合了细胞学、遗传学、免疫学等技术,使基因诊断更具先进性、精确性和快速,因此大大提高了诊断的特异性和灵敏度。随着基因诊断技术的不断改进和日臻成熟,其涉及领域和应用范围不断扩大,特别是80年代中期聚合酶链反应(PCR)技术的问世以及90年代初人类基因组计划的启动,进一步推动了基因诊断技术的发展。1999年11月,美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了《TheJournalofMolecularDiagnostics》杂志,标志着基因诊断技术已经发展成为

3、一个成熟的学科———分子诊断学。分子诊断学是以分子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。回顾分子诊断学20余年的发展历史,大致经历了3个阶段:(1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断;(2)以PCR技术为基础的DNA诊断,特别是定量PCR和实时PCR的应用,不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量,还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量;(3)以生物芯片(biochip)技术为代表的高通量密集型

4、检测技术,生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等,由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法,不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点,而且具有广阔的应用前景和商业价值,因此成为分子诊断技术领域的一大热点。分子诊断技术的应用针对传染病的分子诊断技术：现有的很多诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷，聚合酶链式反应、单克隆抗体等分子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传染病诊断的水平，使死亡率降低。分子诊断技术在微生物学研究领域已显出优势：细菌鉴定有很多方法，传统方法如表型表达和生物化学技术等，但

5、操作费时和技术复杂。诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周。如果不能对细菌进行快速精确的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素,因而引发无效治疗和细菌耐药性。随着分子生物学的发展，对细菌的分子诊断技术正在成熟。DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种/株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的分型比传统方法更为准确。DNA的分析方法有多种，如定量PCR、分子杂交(包括基因芯片)和DNA序列分析等。而只有DNA序列测定分析是黄金标准。很显然，DNA包含的遗传信息存在于DNA和ATCG排列次序中，搞清ATCG排列次序对DNA分析来

6、说就是终结指标。如对诸如16SRNA和内源RNAseP基因的序列分析可以判断很多不同种类细菌或同种细菌的不同亚种/株系。但16SrRNA基因的序列分析不能用来分析炭疽热细菌,因为anthracis与B1cereus具有同样的16SrRNA序列。对内源的RNAseP基因的序列分析可以判断不同种类细菌或同种细菌的不同亚种。分子诊断技术是新变异的病原体检测的最有效的手段之一。如：SARS。常见的分子诊断方法核酸分析技术PCR5’3’延伸延伸5’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理反向PCR(reversePCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA

7、片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。已知序列未知序列未知序列高浓度引物低浓度引物不对称PCR多重PCR（复合PCR）电泳引物12341234LP-PCR（Labelledprimers)ＰＣＲ观察锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）原位ＰＣＲ：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。ＲＴ－ＰＣＲ：逆转录酶ＤＮＡ聚合酶PCR扩增mRNA杂化双链cDNA荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进

8、行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。