n糖基化修饰对突触细胞黏附分子syncam调节突触可塑性的影响

《n糖基化修饰对突触细胞黏附分子syncam调节突触可塑性的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、N糖基化修饰对突触细胞黏附分子SynCAM调节突触可塑性的影响【摘要】目的:观察N糖基化对突触细胞黏附分子(SynCAM)调节突触形成作用的影响。方法:制备SynCAMN糖链定点突变质粒和正常SynCAM表达质粒转染海马神经元细胞,膜片钳试验观察突触中的转染质粒的海马神经元作为突触后部分其动作电位的潜伏期和频率。结果:突变SynCAM质粒组海马神经元动作电位潜伏期为(180.9±3.5)ms(n=14),频率为(10.2±0.7)/s(n=14)。正常SynCAM质粒组海马神经元动作电位潜

2、伏期为(174.7±4.8)(n=14),动作电位频率为(10.0±0.8)/s(n=14),差异无统计学意义。结论:有无N糖链缺失的SynCAM对突触功能的影响无明显差别,下游信号蛋白可能影响SynCAM调节功能。【关键词】SynCAM;N糖基化修饰;突触后电活动突触细胞黏附分子(SynCAM)是最近发现的大脑特异性表达的细胞黏附分子(CAM)[1],属于免疫球蛋白超家族的一员,主要是分布在突触前后膜作为同嗜黏附分子跨越突触间隙[2]。在大鼠实验中发现新出生大鼠脑中没有发现表达SynCAM

3、蛋白,但出生后3周内之一突触形成的重要时期表达量增加[3]。海马CA1区神经元内保持一定钙离子浓度是维持突触可塑性是必须条件[4]。SynCAM的引人之处在于其活动不仅局限于黏附,而且是非钙依赖的,9同时还参与突触的融合和分化。研究发现SynCAMIg样结构域对其调节作用影响重大,而分析Ig样结构域发现存在N糖基化修饰位点,并且SynCAM只受N糖基化修饰。由于N糖基化修饰在参与细胞与细胞黏附、识别以及蛋白受体调节的细胞表面蛋白中发挥着重要作用,因此我们通过定点突变造成SynCAM胞外Ig

4、样结构域N糖基化修饰缺失,转染海马神经元,通过电生理试验观察海马神经元突触后电活动的差异,进行N糖基化调节SynCAM突触功能的初步研究。　　1材料和方法　　1.1材料孕15～16d雌性SD大鼠由上海医科大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、EGF、bFGF、B27胎牛血清购自GIBCO公司。多聚赖氨酸,2.5g/L胰蛋白酶消化液、GoatantirabbitFITC、DonkeyantiratTex、DAPI、TritonX100和SynCAM/TSLC1购自sigma

5、公司。dNTPS、EcoRI和XhoI购自Promega公司。PCR试剂和Taqpolymerase购自TaKaRa。纯化试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于中科开瑞公司。大抽质粒试剂盒购自Qiagen。QuikChangeSiteDirectedMutagenesisKit购自Stratagene公司。磷酸钙共沉淀转染试剂盒购自北京博大泰恒技术公司。PNGaseF试剂盒购自Seikagaku公司。　　1.2方法9　　1.2.1原代海马神经元的分离培养分离培养前晚上用多聚赖氨酸包被盖玻

6、片,无菌操作并备用。新生24h的SD大鼠无菌条件下断头处死取全脑,Dhanks液洗数次;分离海马组织,置于冰浴的Dhanks液中,充分剪碎组织;加入同体积1.25g/L的胰蛋白酶,消化20min左右;胎牛血清终止消化,轻轻吹打细胞数分钟,150目网筛过滤,收集细胞悬液;以1100r/min离心5min,倾去上清,用DMEM/F12培养液重悬细胞,轻轻吹打,计数,调整细胞密度为(2～5)×103/cm2,加入终浓度为100mL/L胎牛血清后接种于放有盖玻片的培养皿中,置于37℃、含50mL/L

7、CO2培养箱中培养;12h内禁止晃动。接种后24h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液,至48h时加入终浓度为10μmol/L的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞的过度生长,随后每3d半量换液。　　1.2.2星形胶质细胞的培养纯化P3SD大鼠低温麻醉后乙醇消毒,无菌操作下取大脑皮层并除去脑膜,剪碎组织,加入1.25g/L胰酶消化20min,用滴管吸出组织转移到装有冷的含100mL/LFBSMEM的离心管内终止胰酶作用5min,吸出组织转移到另一支装有冷的100mL/LFBSMEM的离心管内,吹

8、打数次,静置后取上清并吸到另一支离心管内,重复上述步骤2次或3次,所得上清于800r/min离心5min,弃上清,管内加入新鲜100mL/LFBSMEM并吹打成单细胞悬液,细胞计数,调整细胞密度培养,每隔2～3d进行全量换液,9第9日换液后放入孵箱24h,于37℃恒温摇床上280r/min18h。吸去悬液,DHanks液洗2次后常规传代,种入12孔培养板。　　1.2.3SynCAM糖基化位点突变质粒构建及鉴定利用SynCAM全长基因作为模板,对糖基化位点104位、116位、168位和311位存