pi染色检测细胞周期protocol

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1、PI染色检测细胞周期protocol1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。3、细胞染色离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS（含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mLRNaseA，0.2%TritonX-100）4℃避光孵育3

2、0分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43S期占25.

3、73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。FlowCytometricAnalysisofCellCycleFixation1)Collect2×106cells.2)Pelletcellsbyspinningat1,000rpm,4°Cfor5minutes.3)Re

4、suspendcellpelletin1mlofcoldPBS.4)Fixcellsbyadding4mlof-20°Cabsoluteethanol.5)Storecellsat-20°Cinthisfixationbufferuntilreadyforanalysis.(Nomorethan2weeks)Staining6)Centrifuge(asabove)fixedcellsandresuspendpelletin1mlofPBS.7)Add100µlof200µg/mlDNase-free,RNaseAandincubateat37°Cfor30minutes.8)Add100

5、µlof1mg/mlpropidiumiodide(lightsensitive)andincubateatroomtemperaturefor5-10minutes.9)Placesamplesin12X75FalcontubesandreadonBectonDickinsonFACStarPLUS.PI染液配制（100ml）：PI5mg、RNase2mg、1.0%TritonX-1000.25ml、生理盐水65ml、枸橼酸纳100mg，加蒸馏水至100ml，调pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4℃避光保存。注意事项：1在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞；          2

6、固定液：70%酒精要在-20预冷；          3细胞要选用活力高的。流式细胞PI单染中为什么用RNAse？在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。做流式细胞时，PI染色，PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么？100ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很

7、散，再进行染色PI的配置deardeer：PI怎样配制？怎样保存？有的文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有影响吗？如果不这样，那直接加入而不用柠檬酸钠溶解可以吗？andywang：我用来做流式的PI配制方法是:5mgPI+0.1mlTritonX-100+3.7mgEDTA+10mlPBS,4度避光保存。为储存液，用时稀释10倍。