大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶ampkelisa试剂盒

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1、大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)ELISA试剂盒本试剂盒仅供研究使用。检测范围：96T0pg/ml-160pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)水平。用纯化的大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催

2、化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)浓度。试剂盒组成130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶2酶标试剂6ml×1瓶8标准品（160pg/ml）0.5ml×1瓶3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进

3、行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。3.血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。4.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5.尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、

4、脑脊液参照此实行。6.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。7.培养细胞检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。8.组织标本切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂,用手工或匀浆器将标本

5、匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。自备材料1． 蒸馏水。2． 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。3． 振荡器及磁力搅拌器等操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。2.80pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液4opg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液20pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液10pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入

6、150μl标准品稀释液5pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液3.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。5.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。7.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，

7、空白孔除外。8.温育：操作同3。9.洗涤：操作同5。10.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.11.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。12.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据