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1、常用细胞凋亡检测方法更新日期：2009-03-23受关注度：324920[哪个强:丁香园医学搜索引擎搜狗有道百度谷歌]·上一篇：细胞冻存、解冻方法与细胞计数·下一篇：没有了·挑错·推荐·打印生物医学药学信息产业实验机构人物论坛,分子生物学,基因芯片,细胞生物学,神经生物学,细胞,分子,基因,研究动态,生物产业,人才,招聘,求职,神经科学,生物学,功能基因组学,基础医学,功能蛋白组学,生物信息学,生命科学,生物技术,生物芯片,基因芯片,基因工 一的形态学检测1光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细
2、胞的体积变小变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体贴壁细胞出现皱缩变圆脱落 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色瑞氏染色等凋亡细胞的染色质浓缩边缘化，核膜裂解染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判的进展情况 常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258)，DAPI三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区紫外光激发时发射明亮的蓝
3、色荧光 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10ug/ml DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10ug/ml 结果评判：过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体图1：3透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细
4、胞体积变小，细胞质浓缩凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构图2：；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚边缘化；的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 二磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中图3：Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合
5、蛋白，能与PS高亲和力特异性结合将Annexin-V进行荧光素（FITCPE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测的发生 碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来 方法： 1悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5～1×106）用PBS洗2次，
6、加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照 2贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰消化，洗涤染色和分析同悬浮细胞 3爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察 结果图4图5：注意事项
7、： 1整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞 2操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测 时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50～kbp长的DNA大片段，或180～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移（TdT）使
8、DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成 1大分子染色体DNA片段的测定 的早期,染色体断裂成为50～kbp长的DNA大片段所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为
