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1、基因枪转化法获得草地早熟禾（Poa中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(8):10～14基因枪转化法获得草地早熟禾(PoapratensisL.)转基因植株信金娜韩烈保刘君韩秀宾(北京林业大学草坪研究所北京100083)摘要将与植物抗旱耐盐有关的BADH—CMO双基因,CMO单基因,DREB1A单基因三种外源基因利用基因枪法分别轰击草地早熟禾的胚性愈伤组织,在附加lOOmg/L潮霉素的继代培养基筛选和附加50mg/L潮霉素的再生培养基中壮苗1个月,将抗性植株移栽到花
2、盆中.经过PCR检测,Southern杂交分析,证明BADH—CMO双基因,CMO基因,DREB1A基因已经成功整合到草地早熟禾的植物基因组中.关键词草地早熟禾BADH—CMO双基因DREB1A基因CMO基因中图分类号:Q789DREB1A转录因子可以调控多个与植物干旱,高盐及低温有关的功能基因的表达,利用转录因子来改良植物抗逆性,能获得较为理想的综合效果,DREB1A转录因子目前已经成功地用于小麦的遗传转化.甜菜碱是一类广泛存在于生物体内的渗透保护剂.高等植物中,甜菜碱的生物合成经由胆碱一甜菜碱
3、醛一甜菜碱两步反应完成,其中第一步反应,由胆碱单氧化物酶(CMO)催化,第二步是在甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的催化下将甜菜碱醛转化为甜菜碱.采用BADH,CMO单个基因对植物转化已有报道.如沈义国等获得耐1.2%NaC1盐浓度的转CMO基因烟草植株,张艳敏等获得了耐盐耐旱性显着提高的转BADH基因的小麦植株.草地早熟禾是我国北方广泛应用的草坪草种,以往对草地早熟禾遗传转化多为抗除草剂,报告基因转化等方面的研究,对草地早熟禾进行功能基因转化的较少.本试验首次运用本实验室构建的BADH—CMO双基因对
4、草地早熟禾进行转化,以期获得较高的抗旱,耐盐性状.同时也把CMO单基因,DREB1A单基因表达载体转化到草地早熟禾愈伤组织中,获得了草地早熟禾的转基因植株.收稿日期:2006-05-22修回13期:2006-07-31国家转基因植物研究与产业化专项项目(J2002一B-006)资助,国家"863"计划资助项目(2001AA244082),教育部"新世纪优秀人才支持计划"资助项目}}通讯作者,电子信箱:hanlb@tom.net1材料和方法1.1植物材料供试草地早熟禾品种有:"Baron","Mar
5、dona","Midnight",采用成熟种子为外植体诱导胚性愈伤组织,诱导培养基分别为P2:MS+2,4一D(1ing/L)+6-BA(0.1mg/L)+CuSO(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/L),KM:MS+2,4-D(2mg/L)+6-BA(0.2mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L),P5:MS+2,4-D(2mg/L)+6一BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)[7i,再生培养基为AK2:MS+KT(0.2rag/L)+6-BA(1mg/
6、L),KBN:MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L),AL2:MS+6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L).经诱导培养基诱导和继代培养的胚性愈伤组织作为基因枪转化的靶材料.1.2表达载体DREB1A基因的表达载体为pCAMBIA1301,包含DREB1A和Gus基因,分别由ubi及CaMV35S启动子驱动,筛选基因为hpt(图1).BADH—CMO双基因表达载体为pCAMBIA1303,包含BADH和CMO基因,分别由ubi及CaMV35S启动子驱动,
7、筛选基因为hpt(图2);CMO基因表达载体为pCAMBIA1303,包含CMO和Gus基因,分别由曲i及CaMV35S启动子驱动,筛选基因为hpt(图3).这些表达载体均由北京林业大学草坪草实验室构建并保存.2006,26(8)信金娜等:基因枪转化法获得草地早熟禾(P0.pm把L)转基因植株11其中DREB1A基因序列长为650bp,BADH基因序列长为1500bp,CMO基因序列长为1300bp.hpt35SDREBIAUbi35SGIl图1DREB1A基因表达载体结构图Fig.1Struct
8、ureofDREB1Aexpression图2BADH—CMO双基因表达载体结构图Fig.2StructureofBADH—CMOdoubleexpression图3CMO表达载体结构图Fig.3StructureofCMOexpression1.3基因枪转化方法采用美国Bio.Rad公司的PDS一1000/He型基因枪,具体操作方法参照说明书.具体采用的参数为:采用Ca(NO3)2+PEG4000包被质粒DNA;使用1m金粉作为质粒DNA的载体;选择打枪高度6cm,轰击1次,无渗
