利用聚乙二醇(简称peg)为媒介物进行细胞融合实验报告

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1、细胞生物学实验报告题目：利用聚乙二醇（简称PEG）为媒介物进行细胞融合姓名：余振洋学号：200900140156系年级：09级生科3班时间：2011/3/10一、【实验目的】1、了解细胞融合的基本原理。2、掌握利用聚乙二醇（PEG）为介导物对各类细胞的融合方法。二、【实验材料】试剂：1、Alsver液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl0.42g，溶于100ml双蒸水中。2、0.85％生理盐水3、GKN液：NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4·2H2O1.77g、Na2HPO4·H2O0.69g，葡萄糖2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml蒸馏水中。4

2、、50％PEG液：实验前临时配制，根据需要称取定量PEG（Mw=4000），放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。器材：显微镜，离心机，水浴箱，离心管，滴管，载玻片，盖玻片三、【实验原理】细胞融合(cellfusion)是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象称为细胞融合,结果产生杂交细胞(hybrid)，亲本相同的融合细胞称为同核体(homokaryon),反之称为异核体(heterokaryon)。当前普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细

3、胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为：1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。四、【操作步骤】1、取鸡血2ml和2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（可在4℃保存）2、取（1）中溶液1ml加上4ml0.85％的NaCl溶液，混匀后1200r/min离心5分钟，去除上清液。3、取上步剩余的沉降血球（约0.1—0.2ml），加入GKN液至1—2ml，使之成1

4、0％的细胞悬液。4、取上述10％的血球悬液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000万个，即1.5x108个/ml。5、取（4）中血球悬液0.5ml和0.5ml50％的PEG液于一新离心管内，置于水浴锅，作用2~3min，用吸管吸取半滴该悬液，滴片，显微镜下观察。五、【试验结果及绘图】阶段一：两细胞接触，粘连；细胞膜形成穿孔；(10x40)阶段二：两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞连成一体；(10x40)阶段三：细胞完全合并，形成一个含有两个核的细胞。(10x40)六、【结果分析与讨论】在镜检过程中发现，视野中处于融合状态的细胞数目较少，即细胞融合率较低。经过分析与查资料得出影响细

5、胞融合率的因素，如下：1、PEG的分子量与浓度:细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2、PEG的pH值:经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3、PEG的处理时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4、融合时的温度:由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,

6、在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。结合实验情况，总结出最有可能的是第三条和第四条因素，即反应的温度和时间。由于实验当天温度较低，而且操作时是按照老师板书上所写“2~3min”所做，故有可能导致PEG的作用不完全，从而使得细胞融合率下降。附：细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十

7、分重要的意义。如：制备单克隆抗体：使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)的杂交瘤细胞。单克隆抗体具有专一性和灵敏性。作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。1985年,中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体,同时还与有关医学部门合作,成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克