植物抗旱生理指标测定原理及方法

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1、植物抗旱生理指标测定原理及方法生命科学学院杨歌指标测定：一、可溶性糖（蒽酮法）二、脯氨酸三、丙二醛四、叶绿素五、蛋白（考马斯亮蓝法）六、超氧化物歧化酶（SOD）七、过氧化物酶（POD）八、谷胱甘肽（GSH）九、电导率一、可溶性糖含量的测定1.蒽酮法1.1原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在可见光吸收峰位620nm。测定对象：几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（反应液中的浓硫酸可以把多糖水解

2、成单糖而发生反应，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量）。1.2步骤试剂：(1)浓硫酸；(2)蒽酮乙酸乙酯试剂：蒽酮------------1g加乙酸乙酯至----50ml实验步骤：（1）称取样品0.1g，置于研钵中，加4mlddH2O研磨成匀浆，8mlddH2O洗涤研钵。（2）100°C沸水浴10min，冰上冷却。（3）4000rpm离心10min。（4）取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。（5）1ml提取液+1mlddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸，轻轻混合均匀，

3、100°C沸水浴10min，冰上冷却。（6）620nm处测吸光值。1.3计算方法可溶性糖含量% = C*V/(W*10^6)*100% V为植物样品稀释后的体积（ml）------100mlC为提取液的含糖量（μg/ml）--------根据标准曲线计算W为植物组织鲜重量（g）-------------0.1g问题及质疑：1.目标糖含量：标准曲线是用葡萄糖位标准制作的，而蒽酮法是测总糖的量，包括己糖、戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖，将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线，有一定误差存在。注：查看所

4、有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。2.误差分析：（1）不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成误差。（2）蒽酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中，出现浑浊现象，影响反应进行。（3）介于以上原因，将上清5ml转移至100ml容量瓶定容，稀释程度过大，当糖含量少的时候，大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。方案修改意见：1.首先，做五到六组空白，测试分光光度计误差程度。2.增加平行组数，由三组增加至五组，减少每个样品测试次数。

5、3.改变测试样品定容量，由100ml变为50ml。脯氨酸含量的测定1.茚三酮法1.1原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸

6、的含量。1.2步骤试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶；（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；（3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g加蒸馏水至------100ml实验步骤：（1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷却，4000rpm离心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2

7、ml混合均匀，100°C沸水浴30min，冰上冷却；（4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min；（5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。1.3计算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝X*提取液总量（ml）/样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*10^6公式中：X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）提取液总量---------------------------5ml测定时提取液用量---------------------2ml问题及质疑：1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后

8、的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：（1）反应体系的PH控制很重要，保持酸性环境，否则，反应产物的最大吸光值并不在520nm。（