超高分辨活细胞成像系统技术讲述

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1、GE超高分辨活细胞成像系统利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态。活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。一、活细胞成像系统原理目前主流的活细胞成像系统从原理上可以分为两大类：Ø基于宽场反卷积技术

2、Ø基于共聚焦技术两种技术作为目前最流行的活细胞成像技术，均可以实现在维持细胞存活的情况下，快速获取单一焦平面的信号，在具体性能上则各有擅长。宽场反卷积技术对光线进行反卷积运算是光学成像领域的成熟技术，最早由美国国家航空航天局开发并成为观察微弱天体信号的标准技术。去卷积和共聚焦技术是光学显微镜领域获得单一焦平面光线的两大主流技术(J.M.Murray,livecellimaging,2010)。通过将非焦平面的光线还原至焦平面上，大大提高了样品信号的强度以及图像的信噪比。由于去卷积技术设计到大量的后期运算，因此在高性能计算机发明以前，一直受制于运算能力，没

3、有得到大规模的推广。随着近年来计算机性能的大幅提升和价格的下降，去卷积技术逐渐成为光学显微镜的主流技术。一个点光源经过显微镜的光路，由于镜片对光线的衍射和散射，最终呈现在观察者面前的是一个模糊的点，所以点光源变成模糊的点的过程即为卷积。反卷积就是把模糊的点还原成点光源的过程。以API公司的DeltaVision系统为例，其反卷积过程经历以下几步：1)首先通过无数的计算和实验，得到点光源经过显微镜物镜后变模糊的规律，建立模型。2)选择完美的物镜，保证样品信号经过物镜后变模糊的规律符合步骤一中得到的模型。3)将通过显微镜光路的所有的光信号进行收集，因为点光源

4、经过显微镜光路后会变成一个空间中的倒圆锥形，所以在收集信号的时候需要很准确的记录信号的Z轴信息。4)对收集到的所有光信号按照步骤一中的模型进行还原，最终将模糊的点还原成清晰的点，客观反映它在空间的位置和强度。目前去卷积技术越来越广泛地应用于生物学图像的研究中。共聚焦技术共聚焦显微镜它采用点光源(pointlightsource)照射标本,在焦平面上形成了一个轮廓分明的小的光点(lightspot),该点被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到探测器。探测器前方有一个针孔(pinhole),几何尺寸可调。这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测针孔范

5、围之内,而其它来自焦平面上方或下方的散射光,都被挡在探测针孔之外而不能成象。光束扫描器又分为单光束、多光束或狭缝扫描器几种。其中单光束扫描获得的图像质量最好,狭缝扫描器虽然产生图像的速率很高(可达实时水平),但其图像信噪比低于单光束扫描,这是因为从狭缝长轴来的漫射光不能被有效遮挡。多光束扫描如碟片式共聚焦是由电动马达驱动Nipkow盘旋转而实现的,其荧光量较低,速率一般较高。宽场反卷积技术与共聚焦技术比较表二、API高分辨活细胞成像系统的主要特点DeltaVision活细胞成像系统有以下优势：1）高灵敏：得益于精密和高效的光路，以及领先的还原型反卷积技术

6、，DeltaVision将宽场显微镜的灵敏度和分辨率提高到新的水平，标准配置下最低可以探测到13个GFP分子，成为目前为止最灵敏的光学显微系统之一。HIV病毒通过DC细胞和T细胞的接触侵染T细胞，绿色颗粒为HIV病毒1）高速：标配下可达到21帧/秒（512×512）的成像速度。当配备EM-CCD后，最高可达到224帧/秒（64×64），可用于囊泡运动和钙火花等快速的生理生化过程观察。2）低光毒性：得益于灵敏度的显著提高，即使微弱的荧光，也可以收集到足够的信号，因此激发光的强度和时间可以大幅度减少。光损伤和光淬灭不再是活细胞和微弱荧光观察的障碍。3）智能：

7、焦点漂移和细胞脱离视野是活细胞观察的梦魇。DeltaVision特有的自动对焦（autofocus）和细胞跟踪（celltracking）功能，不仅可以自动维持焦平面的稳定，而且能够跟踪移动的细胞，使这些问题迎刃而解，长时间连续的活细胞观察不再困难。通过对荧光信号和细胞轮廓的识别，DeltaVision可以精确的跟踪需要观察的细胞。4）免维护：整个系统无易损易耗部件，光源寿命在5000小时以上，可正常使用7-10年以上，无需更换光源和校准光路。。系统控制和图形处理基于Linux操作系统，更适合多线程控制和数据处理，不仅大幅度降低了数据处理时间，也避免了在

8、数据传输过程中感染病毒的危险。人性化的softWoRX软件简单易用，一个对话框内