三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞ca2 流动性的影响

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1、收稿日期：2010-07-25接受日期：2010-09-02本研究由上海市博士后科研资助计划面上项目(No.09R21413200)，上海市科委基础重大项目(No.06aj14003)和上海市重点学科水生生物学建设(No.S30701)资助项目*通讯作者。Tel:021-61900051,E-mail:zyshi@shou.edu.cn三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞Ca2+流动性的影响施志仪*郝莹莹李文娟韩健靳雨丽（上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室，上海201306）关键词三角帆蚌；外套膜细胞；非损伤

2、微测；Ca2+流动性三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国主要的育珠母蚌，其所培育出的珍珠色泽鲜艳、细腻光滑，因而成为目前淡水育珠生产中首选的育珠母蚌之一。蚌的外套膜是贝壳和珍珠形成的重要组织器官，有内外两层表皮细胞及其间的结缔组织构成。它对钙具有高度通透性[1~3]，其上皮细胞具有通过细胞膜主动吸收Ca2+和贮存Ca2+的功能[4]，并通过胞吐作用排出钙至外套膜外腔中，这些钙就是形成珍珠的基础。维生素D3可促进Ca2+的吸收和增加钙的运转，对钙吸收起着重要作用[5]。对贝类的研究表明，适量维生素D3能够促进矿物

3、质在贝壳中的沉积[6]。而促进贝壳和珍珠很好的生长的一个不容忽视的因素是环境中的钙浓度[7~9]，水体环境Ca2+升高，可增加外套膜组织Ca2+浓度[10]。研究表明，60~80mg/L的Ca2+浓度最有利于促进三角帆蚌珍珠质沉积[11]。此外，温度对外套膜细胞的珍珠质的沉积也有影响[12]，温度过高或过低都会影响珍珠质分泌，甚至造成蚌体死亡。非损伤微电极测定技术(Non-invasivemicro-testtechnology，NMT)在细胞和组织水平进行功能鉴定、跨膜生物信息传递机制研究等方面发挥了重要的作用[13]。国内

4、外已经有许多研究者运用NMT对生物Ca2+流动进行了研究。本研究运用NMT在不同浓度Ca2+、维生素D3以及不同温度的培养条件下，研究三角帆蚌外套膜细胞外的Ca2+的流动特性，以期为三角帆蚌Ca2+代谢的分子调控机制的研究提供资料，也为日后提高珍珠培育产量提供理论基础。本试验采用2龄的活力较强的三角帆蚌，蚌体大小(长宽高为11×8×3cm)，由浙江诸暨养殖基地提供，育珠蚌在小型玻璃水族缸(40×30×20cm)中暂养，所用的都是曝气的自来水，调节其含钙量约为1.25mmol/L。本试验所用试剂和仪器有：维生素D3(上海生工)，

5、二甲基亚砜(DMSO)(天根生化科技)，RPML1640培养基、抗生素(青霉素、链霉素各10000U/ml)、优级胎牛血清(上海博升生物)，胰蛋白酶、EDTA（Gibco公司)，全培养基(RPML1640+20%胎牛血清+200U/ml双抗[14])，0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)，VD3孵育液用二甲基亚砜溶解为40000U/L的储液，Ca2+孵育液用无水CaCl2配成为0.5mol/L的储液，测试液使用无Ca2+Hanks(C0218，碧云天)配成。恒温细胞培养箱(REVCO，美国)，倒置显微镜(Olympus，

6、日本)，非损伤微电极测定(BI0-001系列，美国扬格公司)，超净工作台中(苏州净化设备厂)。外套膜组织细胞的培养：取3只蚌用手术刀切开蚌的闭壳肌，用无菌蒸馏水反复冲洗外套膜，采用撕裂法分离出外套膜外表皮[15]，再浸入双蒸水配制的0.01%高锰酸钾溶液中30min7进行初步消毒。然后依次用含有3个浓度梯度的双抗(青霉素+链霉素)的PBS冲洗，3个浓度梯度依次为：不添加双抗的PBS；含有200U/ml双抗的PBS；含1000U/ml双抗的PBS。然后将外套膜外表皮组织剪成1mm2的小片，浸于0.5ml的0.25%的胰酶(含有0

7、.02%EDTA)中37℃消化30min，再用2ml含有胎牛血清的培养基终止胰酶消化细胞，然后将液体吸出，用PBS清洗组织块，将组织细胞贴于培养皿中，在26℃恒温培养箱中倒置培养4小时后再正置，添加2ml全培养基继续培养，共培养组织15份(15个培养皿)。培养24小时稳定后再进行孵育测定。培养的组织被分成3组，其中，第1组9个培养皿采用Ca2+终浓度为0.5mmol/L、1.25mmol/L、3mmol/L测试液分别孵育9个培养皿的组织，即3个浓度，每个浓度3个培养皿组(生物学重复)，30min稳定后进行细胞外Ca2+流动研究

8、[16]。由于NMT测试中，测试液必须含有所要测试的离子，因此，Ca2+测试组中Ca2+浓度不能为0mmol/L；第2组3个培养皿采用瞬时添加的方法用VD3储液(40000U/L)将细胞外测试液VD3分别调节为终浓度0U/L、50U/L、100U/L、500U/L，进行细胞外