工作菌液储存期限验证

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1、工作菌液贮存时间验证方案工作菌液贮存时间验证方案1．目的：确认工作菌液在2-8℃条件下的贮存时间。2．范围：适用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的工作菌液贮存。3．环境条件要求：所有检查在环境洁净度10000级下的局部100级洁净度的单向流空气区域隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物再污染。4．验证方法的依据：《中国药典》2010年版二部。5．验证前准备：5.1验证用菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌[CMCC(B)1010

2、4]大肠埃希菌[CMCC(B)44102]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]5.2培养基的制备：营养肉汤培养基批号：北京三药科技开发公司硫乙醇酸盐流体培养基批号：北京三药科技开发公司营养琼脂培养基批号：北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基批号：北京三药科技开发公司改良马丁培养基批号：北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基批号：北京三药科技开发公司以上培养基按照说明书配制后灌装于洁净的容器中，加塞，按经过验

3、证合格的灭菌程序进行灭菌，培养基的适用性检查应符合规定。5.3稀释液的制备：0.9％无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解至1000ml，121℃灭菌20min。0.05％聚山梨酯80无菌氯化钠溶液：取土温800.5ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至1000ml，121℃灭菌20min。5.4菌原液制备：（1）将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，经30-35℃培养18-24小时。6工作菌液贮存时间验证方案（2）将生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基

4、中，经30-35℃培养18-24小时。（3）将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，经23-28℃培养24-48小时。实验人/日期：（4）接种黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，备用。实验人/日期：6.验证内容：6.1菌种的确认菌种名称代数编号接种日期实验人员金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉6.2仪

5、器设备：实验中所用的玻璃仪器及金属器皿在使用前均经过170—180℃干热灭菌至少60分钟。隔水式恒温培养箱：GRP—9050型北京桑翌科技发展有限公司生化培养箱：SHP-250型上海森信实验仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器：LDZM—75上海申安医疗器械厂天平：DT系列电子天平中国江苏常熟长青仪器仪表厂电热鼓风干燥箱：101-3AB型天津泰斯特仪器有限公司家用冰箱6.3验证过程6.3.1新制备原菌液计数（1）取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌的菌原液，用稀释液0.9％无菌氯化钠

6、溶液，以十倍递增稀释法制备菌液，平皿法计数：6工作菌液贮存时间验证方案菌液名称稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期实验人员金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉（2）取黑曲霉孢子悬液，用稀释液0.05％聚山梨酯80无菌氯化钠溶液，以十倍递增稀释法制备菌液，平皿法计数：菌液名称稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期实验人员黑曲霉6.3.2保存条件的确认：将上述原菌液及各稀释级别菌液包扎好后，置冰箱（2-8℃）保存，原菌液一定时间计数一次，计数方法严格同上，使操作带来的误差减少到

7、最少。6.3.3结果金黄色葡萄球菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期1234567备注：铜绿假单胞菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期16工作菌液贮存时间验证方案234567备注：大肠埃希菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期1234567备注：枯草芽孢杆菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期1234567备注：6工作菌液贮存时间验证方案生孢梭菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期1234567备注：白色念珠菌：贮存天数稀释度稀释日期计

8、数（cfu/ml）计数日期1234567备注：黑曲霉菌：贮存天数稀释度稀释日期计数（cfu/ml）计数日期3691215备注：6工作菌液贮存时间验证方案8.验证结论项目名称：验证内容：验证结论：验证人/日期：复核人/日期：审核人/日期：负责人/日期：6