人抗中性粒细胞胞浆抗体(canca) igm酶联免疫分析

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1、人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA)IgM酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E12779h最低检测限：1ng/ml特异性：本试剂盒可同时检测人cANCA(IgM)，且与其他相关抗体无交叉反应。有效期：6个月预期应用：ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中cANCA(IgM)含量。说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，

2、不会对实验结果造成任何影响。实验原理用中性粒细胞胞浆包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgM进行反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cANCA(IgM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中抗体的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板(Assayplate)：一块（96孔）。2.样品稀释液(SampleDiluent)：1×20ml/瓶。3.辣根过氧化物酶

3、标记抗人IgM稀释液 （HRP-anti-humanIgMDiluent）：1×10ml/瓶。4.辣根过氧化物酶标记抗人IgM（HRP-anti-humanIgM）：1×120μl/瓶（1：100）。5.底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。6.浓洗涤液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。7.终止液（StopSolution）：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。需要而未提供的试剂和器材1.标准规格酶标仪2.高速离心机3.电热恒温培养箱4.干净的试管和Eppendof管5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时

4、，最好用多通道移液器6.蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2小时或室温过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：首先通过文献检

5、索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算抗体效价时，稀释了“N”倍，标本中抗体的效价为“N”。辣根过氧化物酶标记抗人IgM的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM加990μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样

6、品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1.加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔加待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。4.依序每孔加底物溶液90μ

7、l，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见孔内有明显蓝色，即可终止）。5.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。6.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。注：1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。3.为防止样品蒸