紫外与荧光实验讲义

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1、实验一绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数一.实验目的通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453UV-Vis的使用方法。学习导数光谱计算方法及特点。二.实验原理1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。为了清楚地描述各种物质对紫

2、外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。根据比尔定律：A=εbc式中A—吸光度ε—摩尔吸光系数b—液槽厚度，单位：厘米c—摩尔浓度，单位：mol/l摩尔吸光系数可按下式计算：ε=实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。通常可以获得1-4阶导数光谱。在各阶导数光谱中，吸光度

3、对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：。其中s为导数的阶数。因此，可以利用导数光谱进行定量测定。导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。一.实验仪器和试剂1.Agilent8453UV-Vis分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.25ml容量瓶，50ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸0.400g/l，苯丙氨酸2.00g/l;5.去离

4、子水二.实验步骤1.波长测定（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l,苯丙氨酸720mg/l；（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm——450nm间测定他们的吸收光谱。2.导数光谱：应用软件中的Math下的Derivate功能，设置参数，分别计算出两种氨基酸标准溶液的1阶导数光谱图。三.数据处理1.以λ为横坐标，A为纵坐标作出吸收光谱2．根据ε=，先在吸收光谱上找出峰值波长及相应的吸光度，然后计算试液的摩尔浓度。3．一阶导数光谱的绘制：对于测量到的一组波长等间隔的吸光度值，可用

5、窗口移动多项式最小二乘拟合求导法获得对应波长的导数值：（1）式中j为数据序列中的次序(第j个点)；C为卷积系数，为一矢量；N为归一化因子；2m+1为窗口宽度；△x为变量的间隔(这里为波长)，其上标s为导数的阶数。计算一阶导数时(s=1)，常用二次多项式进行拟合。则卷积系数C中第i个元素为：Ci＝i，(i＝-m,-m+1,…,m-1,m)。而归一化系数为。例如取m=3(窗口宽度为7)时，C＝（-3，-2，-1，0，1，2，3），N=28。这样的参数代入式(1)计算所得，即为一阶导数光谱。要求对测得光谱计算一阶导数光谱，并画图。一.讨论与思考1．比较导数光谱和吸光度光谱

6、的区别，说明导数光谱的作用。2．一阶导数光谱的峰值，对应于原光谱的什么位置？原光谱的峰值所得的一阶导数值为多少？实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量一.实验目的学习不荧光分析法的基本原理和荧光仪的操作。二.实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。利用物质被光照射后产生的，能够反映出该物质特性的荧光以进行该物质的定性分析和定量分析，称为荧光分析。在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱

7、。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光分析的定量基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关。色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。两者的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。三.实验仪器和试剂1.LS-55型荧光分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.50ml容量瓶，25ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸4mg/l，苯丙氨酸100mg/l;5.PH7.4的KH2PO4-K2