细胞工程_植物细胞培养介绍

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1、第二节植物细胞培养的方法植物细胞的培养方法：根据培养基的类型分为:1、固体培养:琼脂、卡拉胶等固化。2、半液半固体培养：固液双层。3、液体培养：震荡、旋转或静置培养。固体培养液体培养：体胚液体培养www.181jianfei.comwww.aitask.comwww.zgup.netwww.gohlw.com根据培养材料分为：····单细胞培养、原生质体培养、固定化细胞培养、小细胞团培养等。一单细胞培养●单细胞培养是从外植体、愈伤组织、细胞团中分离得到单细胞，然后在一定条件下进行培养的过程。●通过单细胞培养可以观察细

2、胞个体的分裂、生长和繁殖情况，可以获得细胞团，进而得到从单细胞形成的细胞系。●从单细胞分裂、繁殖得到的细胞团和细胞系，可以认为具有相同的基因和特性。●用这种细胞系迸行大规模细胞培养，得到较为均一的细胞及其代谢产物。（一）植物单细胞的获得1、从外植体直接分离单细胞●外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。●悬浮液中所含的完整细胞数量很少，分散性较好，可以看作是游离的单细胞悬浮液。2、从愈伤组织分离单细胞1）经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织的薄壁细胞团。2）将细胞团转移到液体培养基中

3、，进行振荡培养，使细胞团分散成为单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去细胞团和残渣，得到单细胞悬浮液。3．通过原生质体再生法获取单细胞1）外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。2）原生质体分离后，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，而获得单细胞悬浮液。（二）植物单细胞培养的方法●由于植物细胞具有群体生长特性，单细胞往往难以生长、繁殖。●为此，需要采用一些特殊技术1.平板培养法●概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm的薄层固体培养基上进行培养

4、，称之为平板培养。●由Bergman1960年首创的，其目的是为了获得单细胞系，并研究其生理生化和遗传上的规律。特点：··---平板培养是选择优良单细胞株常用的方法。因为由平板培养所增殖的细胞团大多来自一个单细胞。---平板培养用的是1mm厚的薄层固体培养基，在显微镜下可对细胞的分裂和细胞团的增殖进行追踪观察单细胞培养过程①单细胞悬浮液的密度：一般为103个／mL②接种单细胞将调整好细胞密度的单细胞悬浮液与50℃左右的固体培养基混合均匀，分装于无菌的培养皿中，水平放置，冷却，即为单细胞培养平板。③培养：将上述单细胞

5、培养平板置于培养箱中培养。④继代培养：选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，接种于新鲜的固体培养基上进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。⑤单细胞平板培养效率的检测所谓植板率即在平板上形成细胞团的百分率2看护培养●概念：有些植物细胞，一旦单离出来，不仅不能分裂、增殖，还可能死亡。●如果用一块愈伤组织（生长旺盛）来哺育单细胞，从而使其正常分裂、增殖的方法，称“看护培养”·特点：方法简便，但不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成。·滤纸起渗透扩散养分作用；愈伤组织块可以促进单细胞的生长繁殖●愈伤组织给单细胞传递了某些

6、生物信息，●或为单细胞的生长繁殖提供了某些物质条件●例如植物激素等内源化合物。单细胞培养过程●将生长活跃的愈伤组织块植人固体培养基的中间部位；●愈伤组织接种几天后，在愈伤组织块的上方放置1片面积为1cm2左右的无菌滤纸，●取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方；●置于培养箱中，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续的分裂和增殖，形成细胞团；●将在滤纸上由单细胞形成的细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系3微室培养1）概念：将接种有单细胞的少量培养基，置于微室中培

7、养，使单细胞生长繁殖的培养方法。★1955年，德若普（DeRopp）首次将接种有单细胞的一小滴液体培养基，在微室中进行单细胞悬浮培养。单细胞微室培养2）接种的细胞必须达到临界细胞密度以上。103个／mL;★密度过低，单细胞无法进行生长繁殖；★密度过高，则形成的细胞团混杂在一起，难于获得单细胞形成的细胞系。3）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动辐度大，培养细胞仅能短期分裂，因此，当细胞团长到一定大小，将其转移到另外培养基上。●DeRopp1955年首先进行微室培养研究，进行单细胞活体连续观察。●Jones1960年

8、首先观察到烟草细胞分裂.4）特点：★微室培养所使用的培养基用量少，可以通过显微镜观察单个细胞的生长、分裂、分化、发育情况。★有利于对细胞特性和单个细胞生长发育的全过程进行跟踪研究。三、单细胞培养的技术关键1.细胞的起始密度·----细胞密度：系指单位体积内的细胞数目，单位：103个／mL·----起始细胞密度：系指开始培养时，单位