常用实验方法和所需试剂的配制

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1、（一）Western-blot实验1.Westernblot主要实验试剂溴酚蓝（BromphenolBlue）丽春红（PonceauS）考马斯亮蓝（CoomassiebrilliantblueR-250）吐温-20（Tween-20）β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)十二烷基硫酸钠（SDS）过硫酸铵（APS）TEMED聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液4×浓缩胶缓冲液4×浓缩胶缓冲液甘氨酸Tris碱脱脂奶粉牛血清白蛋白（BSA）硝酸纤维素膜（NC膜）蛋白质Marker和预染Marker通用蛋白裂解/提取试剂BCA法

2、蛋白定量试剂盒Bradford法蛋白定量试剂盒兔源性抗抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgGECL超敏发光液定影液、显影液、X光胶片曝光盒其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）2.Western-blot主要实验试剂的配制方法（1）10%SDS溶液:SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。（2）10%APS：APS20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用。（3）10×电极缓冲液（PH8.3）:SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。（

3、4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL。（5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL、冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL。（6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存。（7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL，4℃保存。（8）10×TBS溶液：Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。（9）TBST溶液：1×TBS溶液

4、1000mL、Tween-20溶液1mL，混匀。（9）丽春红溶液：100g丽春红,5mL冰醋酸，双蒸水定溶至100mL，室温保存。（11）5×上样缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH6.8)0.6mL、甘油2.5mL、10%SDS溶液2mL、β-巯基乙醇（使用前加）0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL，去离子水定溶至10mL，4℃保存。（12）12%分离胶：聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4×分离胶缓冲液0.5mL、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED原液10μL、双蒸水溶至8mL。（13）5%

5、浓缩胶：聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4×浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED原液5μL、双蒸水溶至4mL。（14）NC膜封闭液：脱脂奶粉1g，TBST溶液20mL中溶解，4℃保存。（15）抗体稀释液：TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g，混匀，4℃保存。（16）StripingBuffer：β-巯基乙醇35μL、10%SDS溶液1mL、0.5MTris溶液(pH6.7)625μL，去离子水定溶至5mL，室温保存。3.Western-blot实验步骤（1）总蛋白的

6、提取（采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提）①电子天平精确称取组织50mg（±2mg），放入含有1mL细胞裂解液和适量的PMSF（终浓度为1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆。②取0.5mL匀浆液移入新的2mLEP管内，加1mL蛋白抽提试剂并混匀，静置10min后（偶有颠倒混匀），12000g4℃离心10min。③弃去上清保留蛋白质膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。（2）总蛋白浓度的测定（BCA法）①配制统一的蛋白质标准品：以牛血清白蛋白(bovinese

7、rumalbumin，BSA)的标准品溶液（浓度为1mg/mL）制作蛋白质标准曲线。分别吸取BSA标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS溶液补足到2000μL，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃备用。②配制BCA工作液：按50：1的比例将BCA试剂盒内的A试剂与B试剂进行混合，配成BCA工作液。室温保存，1d内使用。③样品处理：取各样品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待测样品。④加样：先于酶标板上样孔内加入200μLBCA工作液，再分别

8、加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL，酶标仪上震荡3min，充分混匀。⑤测定：将酶标板置于恒温水浴箱中，37℃孵育30min。用MRK3型酶标仪测定562nm波长下各孔吸光度值（opticaldensity，OD），采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。（3）样品浓度的配平和制备①配平：