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1、大型真菌分离与保存技术这里的大型真菌主要是指蕈菌，通常说的食用菌这块或蘑菇。(一)、菌种分离及保藏菌种分离是对真菌菌丝的纯化过程，是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。1.孢子分离法蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法
2、来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。（1）采集孢子采集孢子首先要选好的子实体。一般选用个体健壮，特征典型的子实体，将选好的子实体采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75%酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩。这套孢子收集装置需事先进行高
3、压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20°C的室内,经24-48小时左右，可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。在野外时，可用火烧红消毒的刀切割一小块组织，用硅酮粘在培养皿盖子内面上让孢子弹射到培养基上。2.孢子分离多孢分离法：即把多个孢子接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易。（１）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的
4、滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24°C恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，长势旺的菌落，转接于新试管培养基上再行培养。（２）涂布分离法：按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培养皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上经24°C恒温培养萌
5、发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。单孢分离：就是将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法，单孢子分离的方法，按分离的手段可分为以下三种。（１）稀释分离法：这是通过不断稀释孢子悬浮液，使孢子分散最终孢子浓度控制在300-500个孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均匀涂布，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如下：制备无菌水试管:取10支试管,其中1支装100毫升蒸馏水,其它9支装9毫升蒸馏水,经高压灭菌即成无菌水。制孢子悬液：取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入10毫升
6、无菌水试管中,摇振使孢子分散成悬液,用无菌1毫升移液管吸取1毫升孢子悬液于第2支试管中,摇振使其分期,再从第2支试管中吸取1毫升注入第3支试管中,如此反复稀释直到孢子浓度达到300-500个孢子/毫升,备用。制培养基平板：配制PDA培养基,装入三角瓶中进行高压灭菌,准备倒平板的培养皿也经过高压灭菌备用,待已灭菌的PDA冷却至50-60°C时,在无菌操作下倒15-20毫升PDA至培养皿中,培养皿放平,昼使培养基表面光滑,厚度一致。孢子涂布：在无菌操作下，吸取0.1毫升的孢子悬浮液滴在平板培养基表面上,使用T氏棒把孢子均匀涂布在平板上,盖上刺激菌丝培养皿,
7、放置于24-25°C恒温箱中培养。挑选单孢子萌发菌落：一般孢子经过５天的培养开始萌发长出菌丝，培养皿经过显微镜的镜检确定孢子萌发的菌落是由单个孢子萌发成长而成的，可使用打孔器进行打孔把该菌落移接至新鲜的PDA斜面试管中继续培养。打孔器的外径应小于显微镜的视野范围，而且打孔之前须检查该菌落周围是否有孢子或其它菌落，昼使打孔不会触及周边的孢子或菌落，确保纯种。（２）毛细管法：孢子悬浮液经过稀释，使用毛细滴管把孢子悬浮液滴一小滴于皿盖内，昼使每一滴只含有一个孢子，从而达到单孢子分离，其方法如下：孢子悬浮液制备同稀释分离法，孢子浓度控制在200-300个孢子/
8、毫升。毛细滴管制备:取洁净的玻璃管在酒精喷灯上先拉成外径1毫米的细管,稍冷却后再加热并迅速拉长
