用免疫学相关实验技术及方法

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1、第二十一章常用免疫学相关实验技术及方法第一节免疫学方法概论一、免疫学方法的发展史1796年：Jenner发明了接种牛痘方法预防天花2个世纪后被广泛接受1979年WHO宣布天花灭迹19世纪末期：koch发现病原体是感染性疾病病因促进了实验免疫学的发展19世纪80年代：Pasteur预防鸡霍乱的疫苗狂犬病疫苗1888：Behring发现了抗体Methchnikoff发现了巨噬细胞20世纪初：发现了调理素，体液因素可影响吞噬细胞功能1900-1930：认识了过敏反应，发现了血清病Arthus反应，皮肤反应调理作用，补体结合反应疫苗研究有了新发展：BCG-

2、-结核白喉毒素--白喉1935-1957：抗体纯化，鉴定及测定技术凝胶内沉淀技术，抗原抗体免疫电泳等血清血技术1959-1974：放射标记免疫技术、酶标免疫技术生物素-亲和素标记免疫技术荧光标记免疫技术、金(银)标记免疫等技术化学发光免疫技术、免疫分子转染技术细胞和细胞因子测定技术20世纪70年代后期：免疫及分子生物学技术发展成熟单克隆抗体问世，组织相容性抗原B细胞免疫球蛋白基因重组，T细胞受体1980：PCR技术生物芯片技术转基因动物技术免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程基本参与单位有：抗原抗体免疫细胞和免疫分子第二节体液免疫学方法一、

3、抗原制备1.天然抗原制备(1)粗抗原的提取：冻融法、冷热交替法、超声法(2)粗抗原纯化：选择性沉淀法：盐析沉淀法、核酸沉淀法凝胶过滤和离子交换层析亲和层析法蛋白电泳2.合成抗原制备化学合成高分子氨基酸聚合物，即多肽合成肽与载体蛋白连接后能有效诱导抗体产生免疫应答常用方法：teabagmethod纯化方法：反向高效液相色谱法二、抗体制备1.多克隆抗体(polyclonalantibody)制备在自然免疫或免疫动物后产生的具有不同特异性和亲和性的多种抗体混合分子具有抗多种不同抗原的表位2.单克隆抗体(monoclonalantibody)制备由一个识别

4、一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体产生方法：B细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞3.基因工程抗体(engineerantibody)应用抗体库技术产生将某种动物所有抗体的可变区基因克隆到质粒或噬菌体中并表达利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆，从而获得特异性抗体三、抗体的应用及其相应的免疫学技术(一)酶联免疫吸附测定（ELISA）基本原理是利用酶标记抗体或抗原，使之成为酶标抗体(或抗原)抗原或抗体固定到固相载体表面并保持其免疫活性利用抗原、抗体复合物的免疫学反应原理来测定未记标的抗原(或抗体)(二)放射免疫测定(radioimmu

5、noassay)用于测定组织液和血液中的激素水平在固相载体中标记的特异性抗体（125I来标记）与特定的未标记抗原产生特异性免疫结合非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或洗涤液来封闭特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中，其放射性强度可以直接测定(三)免疫荧光技术(immunofluorescencetechnology)原理是将荧光色素与特异性抗体(或抗原)以化学的方式结合起来，但不影响该血清抗体的免疫特性将荧光标记抗体在特定的条件下浸染标本，使之与标本中相应的抗原产生结合反应反应的结果——产生含有荧光标记的抗原、抗体结合物，

6、可用荧光显微镜观察(四)免疫组织化学技术(immunohistochemistry)检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的方法用化学的方法将酶与抗体结合起来，将标记的抗体与组织切片中的抗原产生特异性的结合结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色酶底物通过化学反应呈色，借助显微镜检测各种抗原物质(五)免疫印迹技术(immunoblot，Westernblot)基本过程是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离通过电转染将已分离的蛋白分子转移到固相膜上在固相膜上用标记(放射标记或酶标记)的特异性抗体检测蛋白质抗原免疫印迹技术结合了凝胶电泳分辩力高和固相免疫

7、测定敏感、简便、稳定等优点OSCCTca8113TbTca8113-MOSC-4OSCCTca8113TbTca8113-MOSC-4AB0510203060120min(六)免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应速度，二是将一些蛋白质组分利用其电荷的不同将其分开分别与抗体反应，以其沉淀线的最高稀释度为抗体的效价1.免疫电泳2.对流免疫电泳3.火箭免疫电泳4.免疫固定电泳5.聚丙烯酰胺凝胶电泳第三节细胞免疫学技术一、白细胞的分离血液中红细胞与白细胞比例为600:1~1000:1两者的比重不同，其沉降速度亦异

8、通常用两种方法加以分离。1.自然沉降法2.聚合物加速沉降法二、外周血单个核细胞的分离包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和