男性生殖相关基因功能研究策略

《男性生殖相关基因功能研究策略》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、男性生殖相关基因功能研究策略男性不育是较为常见的病症，约4％的男性受到不育的困扰。男性原发性不育与男性生殖相关基因的缺陷有密切关系。近年来，国内外发表了大量文献展示了新发现的与男性生殖相关的基因。刘美玲等⋯在采用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选大鼠精原细胞与精母细胞差异表达基因过程中，发现了大鼠睾丸特异表达基因LM23基因。沙家豪所在的重点实验室运用人胚胎和成人睾丸cDNA探针与人睾丸dDNA微阵列杂交，通过差异杂交的克隆进行序列测定和分析，筛选和鉴定出一些与精子发生相关的基因，包括TFIIAalpha／beta—likefactor(ALF)怛，睾丸组织内生精细胞特异表达的NYD

2、—SP5基因J，BGR基因的异构体并在睾丸特异表达的BGR类似基因J，BRDT基因新的选择性剪切突变子，在睾丸特异表达，在一些无精子患者中无表达的BRDT—NY基因等。在发现越来越多与男性生殖相关的基因之后，更大的挑战在于如何确定这些基因的功能，研究这些未知新基因的功能和已知基因的新功能成为一项极其重要的内容。本文综述了当前男性生殖相关基因功能研究的主要策略和最新技术。一、蛋白质相互作用研究生物学功能常常是由多个蛋白质的相互作用共同完成的，因此研究蛋白质组内各蛋白质的相互作用就十分重要。找到一个新基因后，了解与这个基因所编码蛋白相互作用的蛋白，对揭示该基因功能有重大意义J。1．酵母

3、双杂交技术(Twohybridsystem)。酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种研究蛋白质分子之间相互作用的实验技术平台。借此可以揭示功能上密切相关蛋白质分子之间的结构关系，为深入认识机体的生理病理分子机制提供新线索。酵母双杂交系统是由Fields和Song于1998年提出的，作用原理基于真核细胞转录因子的结构特性。这些转录因子通常由两个或两个以上相互独立的结构域组成，分别为DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)，只有当两种结构域共同作用时才能使转录正常进行，来自不同转录激活因子的两种结构域也能使转录正常进行。利用此特性，可以分别使DB与AD同“诱饵”蛋白(x)和“猎物”蛋白(

4、Y)形成融合蛋白，并在真核细胞中同时表达。如果两种蛋白可以发生相互作用，就能使DB与AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录。在检测蛋白质之间相互作用方面，酵母双杂交系统具有非常高的灵敏度，尤其对蛋白质间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感检测到。GuoF等I通过酵母双杂交发现Psap是Rhox5的一种新的相互作用蛋白分子，这两种蛋白分子对男性生殖器官的分化和精子发生都具有重要作用。AzzalinA等”应用酵母双杂交技术成功找到了精子发生相关蛋白DPL的相互作用蛋白RACK1，从而对DPL的作用机制有了更深入了解。目前已存在的还有酵母单杂交系统、三杂交系统、负选择

5、双杂交系统以及用于哺乳动物细胞的双杂交系统等一系列相关的技术。这些技术被广泛应用于蛋白质组学相关领域的研究，成为检测蛋白质相互作用、发现新的作用蛋白、分析蛋白质结构和功能的有力工具。大规模双杂交系统的出现，为分析鉴定复杂蛋白相互作用提供了可行的方法，为建立生物体蛋白质连锁图谱提供了条件。2．蛋白质亲和色谱技术(ProteinAfinityChromatogra—phy)。蛋白质亲和色谱的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件被回收下来。为了

6、更有效地利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。例如，与GST(glutathioneS—transferase)融合的蛋白在经过固定有GSH(glutathione)色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。KimJH与同事利用GST融合蛋白技术(pulldown)对各种hnRNP之间的相互作用进行了鉴定。一般来说，GST融合蛋白方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白质相互作用的未知蛋白质；一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相

7、互作用。该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有广泛应用。此外，还有很多其它常用的蛋白标签，如与葡萄球菌蛋白A融合的蛋白可以通过固定有IsG的亲和柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的蛋白可以通过结合Ni的色谱柱进行纯化。WolfeSA等应用蛋白质亲和色谱技术成功找到RFX2，一种在初级精母细胞中大量表达的转录因子。WangR等应用蛋白亲和色谱技术找到一种新的表达于精子细胞的蛋白“TLRR”。3．SELDI芯片技术(Surface—enhanc