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时间:2018-07-19
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1、制备型色谱柱选择指南制备的目的是从混合物中得到纯物质,即分离—纯化—目标物,制备柱则是完成这一过程的一个工具。其固定相种类和分析柱相似,有硅胶、键合固定相(如C18/C8等)、离子交换树脂、聚酰胺、氧化铝、凝胶等(对填料可以进一步处理提高了分离效果,如:对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理)。其装柱方法,根据固定相颗粒度和柱子的尺寸,有不同的装柱方法,装填越好分离效果越好。如湿法装填,颗粒直径小于20-30um的固定相,柱直径在50mm以内(同分析柱装填方法相似);还有如径向压缩或轴向压缩,柱长压缩技术,柱直径大于50mm时采用。这种方法,先将固定相悬浆(或偶尔是干填充物)装入柱中加压
2、,利用物理方法将其压紧。压缩.jpg(15.38K)2011-9-1415:23:19(轴向压缩图例)为了加快分离时间和提高分离效率,制备色谱的的进样品量将会很大,这导致制备色谱柱的分离负荷的相应加大,也就必须加大色谱柱填料,增大制备色谱柱的直径和长度,使用的相对多的流动相。然而,当色谱柱上样量加大时,往往会导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱,要解决容量与柱效之间的矛盾。因此,制备柱的特点往往是:1.柱长短、内径大、呈圆饼状。常用制备柱的柱长与分析柱相仿,一般为20—50cm,,而内径为10—1000mm,因此可以在较大的流速下不致产生很高的柱压降,从而获得高的产率。2.填料
3、颗粒小,分布窄。采用直径为10—20μm的细颗粒,孔径及粒度分布均很窄的多孔球形或非球形填料替代传统大颗粒(40—200μm)、宽分布的无定形填料填充制备柱,因而具有高得多的柱效,通常每米的塔板数在20000以上,有的甚至可达到与分析柱相仿的柱效。3.流速高。流动相的线速一般在5—10cm/min,以便提高产率,降低生产成本。制备色谱柱Φ50mm以内,可以使用预装柱,但是Φ50mm以上就必须使用轴向压缩柱。轴向压缩柱可分为静态和动态轴向压缩柱。一般Φ50-Φ100mm可以使用静态或动态轴向压缩柱,但是Φ100m以上制备柱必须使用动态轴向压缩柱。制备柱.jpg(21.78K)2011-
4、9-1415:23:19(典型制备柱图例)那么,如何选择一款合适的制备柱呢?第一步:选择合适的填料。越小的粒径具有越高的柱效,但是价格更高,并且带来更高的柱压,要求设备的硬件具备更高的压力耐受性。在被测组分的色谱峰与其它色谱峰非常靠近时,就需要更高的柱效,此时较小粒径的色谱填料就显得非常有用。相反,越大的粒径则柱效越低,但价格也相对较低,同时对设备的要求也不高(10um最常用)。填料.jpg(14.66K)2011-9-1415:23:19(填料)第二步:针对蛋白质、多肽类等物质,选择合适的键合相、孔径。由目前市场需求来看,蛋白质、多肽等类的物质分离纯化十分普遍,其中以C18、C8、
5、C4的键合相居多,如何根据物质分子量的大小,来选择合适的含碳量和粒径是个非常重要的问题。而相同粒径不同孔径的效果也有不同,如100A、200A等,因此,孔径的选择也十分重要。孔径和粒径.jpg(11.23K)2011-9-1415:23:19(孔径和粒径的关系图)物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质粒径分布.jpg(19.83K)2011-9-1415:23:19第三步:选择合适的柱管。样品的上样要与色谱柱的交叉截面面积相对称,要选择色谱柱的内径要适合于样品的上样量(21.2最常用)。越长的色谱柱具有越高的柱效和更高的样品承载
6、量,但是柱压将会更高,同时分离时间可能会更长(250mm最常用)。第四步:确定合适的流速和上样量制备型色谱柱的流速:一般与直径的平方成正比。举例:4.6mm分析柱流速设为为1mL/min,10mm制备型色谱柱可以为1*(10/4.6)2,约为4.7ml/min。上样量的多少即超载多少,这是为了节约溶剂、节省时间、增加柱子的使用率,因此上样量都是超载的。但并不是超载越多就越好,因为超载越多、塔板数越低。一般情况下,是否超载过量,可以以柱效下降一半为标准,在此基础上再超载,所得到的物质纯度就会受到影响,反而达不到目的。允许平头峰:平头峰.jpg(16.33K)2011-9-1415:23
7、:19一般情况下,可参考下图:制备上样量的选择重复性实验min00.511.52Norm.010203040501234
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