重楼叶多糖提取工艺及其抗氧化活性研究.

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1、巴黎重楼叶多糖提取工艺及其抗氧化活性研究[摘要]在单因素分析的基础上，利用中心组合设计实验优化巴黎重楼叶多糖的提取条件。设置三个独立的变量，包括提取温度（℃），水料比和时间（h)并研究其对多糖得率的影响。采用多元回归分析和统计学方法对拟合一个二次多项式方程实验数据进行。最佳工艺条件为：提取温度为90.8℃，水料比为21.3:1，提取时间为4.8h。在最佳条件下，实验的回收率为54.18%，与模型预测值匹配。此外，纯化的多糖对DPPH自由基、羟自由基离子和超氧阴离子自由基有很强的抗氧化作用。[关键字]重楼优化多糖抗氧化1.

2、引言巴黎滇重楼，广泛分布在中国的西南地区，长时间被作为中药使用。它能有效的消肿、有效的减轻疼痛、消除咽喉肿痛、治疗蛇毒咬伤和擦伤[1]。巴黎滇重楼中有许多生物活性成分，如皂甙，蜕皮激素，植物甾醇和黄酮甙[2]。它们被广泛应用于抗肿瘤、抗菌、止血和镇痛[3]。多糖是高分子碳水化合物结构，形成重复单元由糖苷键连接在一起[4]。因为多糖特殊的理化性质和生物活性高，所以对多糖的研究受到了许多关注[5]。然而，一些研究已经从云南滇重楼叶多糖（PPLPs)提取中开展了。热水提取技术是常用的植物多糖的提取方法，已经被广泛应用于许多研究

3、[6]。在提取过程中，提取率是由多个独立变量影响的。因此，开发一个可以确定所有因素的优化方法是必要的。另外，要确定最佳提取条件就应该考虑自变量之间的相互作用。当自变量有一个联合的效果的时候，响应面法（RSM）在优化工艺方面是一种有效的统计技术。RSM的优化过程比传统方法需要较少的材料和时间[7]是一种典型的响应面设计。在本设计中，处理结合在试验点，轴点，中心点。设计是旋转（或接近旋转），要求每一个因子五水平。与传统方法相比CCD能更有效的进行试验。活性氧是细胞代谢过程中产生的副产品。过多的自由基会引起许多疾病，如癌症、心

4、血管疾病、动脉粥样硬化。抗氧化剂和癌症治疗的常规药物，如BHA、BHT和TBHQ的疗效有限并且有显著的毒性[8]。多糖是一种天然的生物大分子，广泛存在于生物界中。因为多糖具有抗氧化、抗癌和免疫活动，所以植物多糖引起了极大的关注。[9]。然而，很少资料是研究PPLPs的。本研究的目的是调查关键变量（提取温度，提取时间和水料比）并进一步优化pplps的提取工艺。另外，对获得纯化的多糖及其抗氧化活性进行了评价。2.材料与方法2.1材料和试剂将巴黎重楼叶干燥，将干燥的材料用粉碎机，然后过60目筛。将巴黎重楼叶粉末分别用石油醚（6

5、0-90℃）和乙醇在索氏抽提器中回流5小时。脱脂后将粉末干燥，室温下放置在干燥器中保存。乙醇，苯酚，硫酸，和葡萄糖分别来自成都科隆化工厂购买。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），1,10-菲咯啉，,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氮蓝四唑（NBT）购自西格玛化学公司。所有化学试剂均为分析纯。2.2提取pplps每个预处理粉末（1.0克），在设定的提取温度，水料比和提取时间下萃取多糖。将所得的悬浮液通过离心（5000r/min,10分钟）分离。收集上清液并加蒸馏水补至100ml。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量[1

6、0]。使用葡萄糖作为标准，并将结果表示为葡萄糖当量。2.3实验设计通过单因素实验确定提取变量的初步范围。设计一个五水平三因素的CCD用于优化pplps的提取率的最佳变量组合。分别选择提取温度（X1），水与原料的比例（X2），和提取时间（X3）用于多糖的提取率待优化的独立变量。三个变量和五个水平的范围如表一所示。提取率（Y）被作为对三个变量在表2中的相互作用的响应。根据等式三个变量进行编码：xi-x0Xi=i=1,2,3(1)△X其中X是独立变量的编码值，Xi独立变量的实际值，X0是自变量的中心点的实际值，和γx为变量的阶

7、跃变化。该系统的行为由下列二次方程解释：3323Y=A0+∑AiXi+∑AiiXi+∑∑AijXij(2)i=1i=1i=1i=1其中Y是预测响应，A0是一个常数，AI，AII和AIJ是由模型估计系数，以及XI和XJ是独立变量。这些数值分别代表的是截距，线性，二次互动变量的影响在响应面中的情况。该模型评价三个变量的影响。所有实验均重复三次。来估计自变量的响应，实验设计进行分析，并使用设计专家软件预测的数据进行了计算[11]。随后，三个额外的实验以验证统计实验策略的有效性。2.4制备和多糖的纯化取预处理的样品（100.0g

8、），采用优化的条件下热水提取方法提取PPLPs溶液。将悬浮液以5000rpm离心10分钟，并且将上清液收集并浓缩至约100毫升。浓缩液采用Sevag法除蛋白[12]。四体积的乙醇加入到浓缩物中，并将混合物在4℃保持12小时。收集沉淀物并真空干燥获得PPLPsPPLPs（1.0克）溶解在去离子水中。该溶液通过DEAE-